破壁提取復方金盞銀盤藥浴包總黃酮工藝研究

王 麗

(廣東嶺南職業技術學院，廣東 廣州 511360)

我國地勢多樣，資源豐富，少數民族眾多，藥浴是少數民族人們日常保健、防病治病所不可缺少的一部分。藥浴也是中醫治療方法中外治法的一種，其歷史悠久。藥浴亦被現代人稱為“綠色療法”。

復方金盞銀盤藥浴包處方取自我國嶺南地區，由金盞銀盤、黃皮葉、黃牛葉、黃桐葉、黃梔子葉組成，民間婦孺皆知，療效確切。主要功效為清熱解毒、消癰療瘡、祛濕止癢，用于治療全身上下的皮膚瘙癢疾病，如濕疹、痱子、蛇蟲咬傷、痔瘡、疥癬等。然而這樣一種家喻戶曉、療效確切的藥浴方藥無確切的實驗依據，不僅不能使其藥效得到充分發揮，也阻滯地方文化傳播，不利于其推廣。鄧書保[1]提出對于地方藥浴文化的系統和整體性保護是對于國家民族文化的保護，需要以多渠道方式進行。此藥浴方藥中的單味藥物有部分報道，都波等[2]用Fenton法檢測出金盞銀盤黃酮成分對·OH有較好的清除作用。滕蓉等[3]研究發現其可抑制金黃色葡萄球菌等菌類。另外，也有研究顯示鬼針草有抗炎、治療高血壓、高血糖、胃潰瘍[4-7]等作用。李娟等[8]運用ELISA法、MTT法、Western Blot法檢測發現黃皮葉提取物可減少炎癥因子。而以金盞銀盤、黃皮葉、黃牛葉、黃桐葉、黃梔子葉為主要成分的復方藥浴方藥的研究，在國內外尚無報道。現對破壁提取總黃酮的最佳工藝進行研究，為其后期開發推廣提供實驗依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV2350型紫外可見分光光度計(尤尼柯(上海)儀器有限公司)；FA1004型電子分析天平(上海衡平儀器儀表廠)；DK-500s型三用恒溫水槽(上海精宏實驗設備有限公司)；DFT250型手提式高速萬能粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)。

1.2 材料

蘆丁對照品(上海如吉生物科技發展有限公司，批號：170115)；纖維素酶(和氏璧生物科技有限公司，批號：2017090802)；氫氧化鈉(天津市大茂化學試劑廠，批號：20160820)；無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉均為分析純，購于天津市百世化工有限公司。

2 方法與結果

2.1 含量測定方法[9]

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取干燥的蘆丁對照品 10 mg，置于 100 mL量瓶中，加60%乙醇適量使蘆丁溶解，冷卻后，用60%乙醇定容至刻度線，搖勻即得濃度為0.1 mg/mL的對照品溶液。

2.1.2 標準曲線繪制 吸取標準液2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL于6只10 mL的比色管中，加30%乙醇使各溶液成5 mL，分別加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，分別加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻放置6 min，分別加1 mol/L氫氧化鈉溶液3 mL，定容至刻度線，搖勻放置15 min，于510 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制濃度X-吸光度Y的標準曲線，見圖1。運用線性回歸法得標準曲線方程：Y=5.437 4X+0.104 9，r=0.999 6，Y為吸光度值，X為濃度mg/mL。結果顯示，蘆丁標準品在0.052～0.117m g/g濃度范圍內具有良好的線性關系。

圖1 蘆丁標準品標準曲線

2.1.3 樣品中總黃酮的測定方法 復方藥材5 kg粉碎，過50目篩，備用，取8 g粉末樣品按比例添加純凈水、纖維素酶，放置燒杯中，同時置于水浴鍋中，設定溫度和時間水浴加熱，過濾得總黃酮樣液，取一定量的樣液，定容，取容量瓶中的樣液測吸光度。

計算公式：X=Y×V×n×100%/m，其中X代表樣品中總黃酮的含量，Y代表樣液中檢測的總黃酮濃度(mg/mL，由標準曲線方程計算而得)，V為樣液體積(mL)，n為稀釋倍數，m為樣品量(mg)。

2.2 正交試驗優選提取工藝結果

為了獲得復方金盞銀盤藥浴包中總黃酮提取的最佳工藝，采用正交實驗法研究各因素及其水平組合對提取效果的影響。經過多次試驗，最終確定影響提取效率最大的因素主要為料液比(A)、纖維素酶用量(B)、提取溫度(C)、提取時間(D)4個因素，本實驗選用L9(34)正交試驗，以復方金盞銀盤藥浴包中總黃酮提取率為指標，確定其提取最優料液比、酶用量、溫度、時間。分別精密稱取復方金盞銀盤藥浴包原料8.000 g(精確至0.001 g)，置于燒杯中，按照表1對應的因素水平進行實驗，結果見表2，方差分析結果見表3。

表1 正交試驗因素水平

根據分析結果可知，復方金盞銀盤藥浴包提取工藝中，各個因素對總黃酮的提取效果影響程度各不相同，影響程度依次為C>A>B>D，其中提取溫度的影響對提取效果有統計學意義。綜合生產及使用的綜合情況，在復方金盞銀盤藥浴包提取工藝中最優的方案是A3B1C3D2，即以料液比1∶40，纖維素酶用量0.008 g，提取溫度為60 ℃，提取時間40 min。

表2 正交試驗設計及結果

表3 方差分析結果

注：F0.05(2，2)=19.0。

2.3 重復性試驗

取備用樣品6份各8 g，在最優提取工藝方案A3B1C3D2(料液比1∶40，纖維素酶用量0.008 g，提取溫度為60 ℃，提取時間40 min)進行提取，過濾得總黃酮樣液，取樣液5 mL，100 mL定容，取容量瓶中的樣液在在510 nm波長處測定吸光度，根據標準曲線方程計算各樣品的總黃酮含量和平均含量，見表4。結果顯示RSD=0.52%，表明該方法重復性良好。

2.4 精密度試驗

取備用樣品8 g，按照料液比1∶40，纖維素酶用量0.024 g，提取溫度為40 ℃，提取60 min的工藝條件進行提取，過濾得總黃酮樣液，取樣液5 mL，100 mL定容，取容量瓶中的樣液在510 nm波長處重復測定6次，結果見表5。計算結果顯示6次總黃酮含量的RSD=0.71%，表明此方法具有良好的精密度。

表5 精密度試驗結果

2.5 穩定性試驗

取備用樣品8 g，按照料液比1∶20，纖維素酶用量0.008 g，提取溫度為40 ℃，提取時間20 min的工藝條件進行提取，過濾得總黃酮樣液，取樣液2.5 mL，100 mL定容，取容量瓶中的樣液每隔5 min在510 nm波長處測定吸光度，并計算總黃酮含量，見表6。結果顯示平均值為69.86 mg·g-1，RSD值為0.91%，表明被測試溶液在30 min內基本穩定。但考慮到吸光度隨時間的延長而下降，本實驗按照第四部《中國藥典》的方法取15 min測量吸光度值。

表6 穩定性試驗結果

2.6 加樣回收率試驗

精密量取已知含量的容量瓶(正交實驗中1號瓶)中定容液(測定總黃酮含量0.086 8 mg/mL)樣品6份各10 mL，分別加入0.1 mg/mL的蘆丁對照品溶液3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL，在510 nm波長處測定吸光度，根據標準曲線方程計算含量，并計算加樣回收率，見表7。

公式為：(C-A)/B×100%

其中A：樣品所含被檢測成分量；B：加入純品量；C：實測值。結果表明，采用UV法測定總黃酮含量的加樣回收率較高，平均回收率為98.14%，RSD=2.26%，因此該方法準確度較高。

表7 加樣回收率實驗結果

3 討論

由于蘆丁和黃酮類化合物均是以2-苯基色原酮為母核，具有相同的吸光度測試性質，因此在實驗中選用蘆丁作為對照品測定藥浴包中總黃酮的含量。

在本次正交設計實驗中，從提取總黃酮的含量可見，提取溫度對于提取效果影響最大，其次分別為料液比和纖維素酶用量，因此，綜合考慮提取效率、生產成本以及患者使用實際情況，確定最佳提取工藝為60 ℃時加入0.008 g纖維素酶，料液比1∶40，提取40 min。本實驗確定的提取工藝操作簡單、穩定性好，適合于工業化生產和日常患者使用。