皂角刺配方顆粒HPLC指紋圖譜研究

姚 娜，黃燕明，陳桂生，李雪銀，康志英

(1.廣州市香雪制藥股份有限公司，廣東 廣州 510663；2.寧夏隆德縣六盤(pán)山中藥資源開(kāi)發(fā)有限公司，寧夏 固原 756300)

皂角刺為豆科植物皂莢GleditsiasinensisLam.的干燥棘刺。全年均可采收，干燥或趁鮮切片干燥。其具有消腫托毒、排膿、殺蟲(chóng)的功效。臨床上用于癰疽初起或膿成不潰；外治疥癬麻風(fēng)[1]。皂角刺中的主要化學(xué)成分研究有相關(guān)報(bào)道，其中皂角刺飲片含有黃酮類(lèi)、皂莢皂苷類(lèi)、氨基酸類(lèi)、酚類(lèi)、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞甾醇、谷甾醇以及二十九碳烷等成分[2-4]；皂角刺的水提取液中含有黃酮、皂苷、酚類(lèi)、有機(jī)酸、糖或苷類(lèi)等化合物[5]。據(jù)文獻(xiàn)可知，皂角刺具有抑菌、抗病毒、提高免疫力、抗氧化、抗腫瘤、抗凝血、抑制血栓形成、抑制靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖等作用[6-7]。中藥配方顆粒也叫免煎中藥飲片，它具有安全、穩(wěn)定、方便、快捷的特點(diǎn)。皂角刺配方顆粒是以皂角刺飲片為原料，經(jīng)水提、分離、濃縮、干燥、制粒、包裝等工藝制備而成。由于皂角刺配方顆粒是經(jīng)過(guò)多道工序制備而成，已不再具備飲片的性狀與結(jié)構(gòu)特征。為了更全面、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)皂角刺配方顆粒的質(zhì)量，本文采用HPLC-DAD法對(duì)其指紋圖譜方法進(jìn)行研究，結(jié)果該方法穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可作為皂角刺配方顆粒質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

十萬(wàn)分之一電子分析天平(MS205DU，瑞士Mettler toledo公司)；超純水器(Simplicity，美國(guó)密理博Millipore公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ500DE，昆山市超聲儀器有限公司)；Ultimate3000 DIONEX高效液相色譜儀；Agilent 1200高效液相色譜儀。

皂角刺對(duì)照藥材(中國(guó)食品藥品檢定研究院，121210-201003，規(guī)格：1 g/瓶)；乙腈為色譜級(jí)；甲醇、正丁醇、氨水均為分析純。

10批皂角刺配方顆粒均來(lái)自廣州市香雪制藥股份有限公司(批號(hào)依次為01～10)；麥芽糊精來(lái)自中糧生化能源(公主嶺)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(柱長(zhǎng)為25 cm，內(nèi)徑為4.6 mm，粒徑為5 μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm；柱溫30 ℃。見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2 參照物溶液的制備

取皂角刺對(duì)照藥材適量，精密稱(chēng)定，加水適量，回流提取1 h，過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙猓D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取皂角刺配方顆粒約1 g，研細(xì)，精密稱(chēng)定，置錐形瓶中，加入1 g硅藻土，混勻，精密加入甲醇10 mL，超聲處理30 min(功率300 W，頻率40 kHz)，過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入氨水10 mL、正丁醇20 mL，充分振搖，靜置，分層，分取正丁醇層，蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙猓D(zhuǎn)移至10 mL量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 測(cè)定法

分別精密吸取參照物溶液與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄色譜。

2.5 10批樣品的檢測(cè)結(jié)果

分別取10批皂角刺配方顆粒，按“2.3”項(xiàng)下方法制備10份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，得到10批皂角刺配方顆粒的色譜疊加圖，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012.1版》對(duì)10批皂角刺配方顆粒指紋圖譜進(jìn)行計(jì)算，相似度達(dá)0.997以上。結(jié)果見(jiàn)圖1-圖2和表2。

圖1 10批皂角刺配方顆粒HPLC特征圖譜疊加

圖2 皂角刺配方顆粒HPLC指紋圖譜共有模式

表2 10批皂角刺配方顆粒HPLC指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.6 指紋圖譜中共有峰的確認(rèn)

通過(guò)對(duì)10批皂角刺配方顆粒的HPLC指紋圖譜進(jìn)行分析，有9個(gè)色譜峰能穩(wěn)定重現(xiàn)，故確立了9個(gè)共有峰。經(jīng)與皂角刺對(duì)照藥材進(jìn)行比對(duì)，4-9號(hào)共有峰的保留時(shí)間及紫外光譜與皂角刺對(duì)照藥材均吻合。Zhou L等[8]從皂角刺中分離得到黃酮類(lèi)成分——表兒茶素。黃桂華[9]對(duì)皂角刺的飲片進(jìn)行了紫外光譜掃描，鄒盛勤等[10]和徐春玉[11]對(duì)表兒茶素進(jìn)行了紫外光譜掃描，其圖譜形狀以及最大吸收波長(zhǎng)均與上述共有峰的紫外光譜相似。故推測(cè)上述共有峰為皂角刺的表兒茶素類(lèi)成分，且其峰面積均大于總峰面積的3%，因此擬定4～9號(hào)共有峰為特征峰1～6號(hào)。

2.7 特征圖譜方法學(xué)考察

2.7.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取皂角刺配方顆粒、麥芽糊精及皂角刺對(duì)照藥材分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，見(jiàn)圖3，結(jié)果表明，6個(gè)共有色譜峰的鑒定均不受溶劑及輔料等因素干擾，具有良好的專(zhuān)屬性。

A．皂角刺配方顆粒，B．陰性對(duì)照，C．空白溶劑，D．皂角刺對(duì)照藥材

2.7.2 精密度試驗(yàn) 取同一批皂角刺配方顆粒供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件于高效液相色譜儀上連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012.1版》進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果各圖譜共有峰與對(duì)照指紋圖相似度均達(dá)1.000，表明該儀器精密度良好。

2.7.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批皂角刺配方顆粒樣品，平行6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果各圖譜特征峰的相似度均達(dá)0.999以上，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份皂角刺配方顆粒供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12、24、48 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果各圖譜共有峰的相似度均達(dá)0.999以上，表明該供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.5 中間精密度試驗(yàn) 分別考察不同分析人員、不同日期、不同設(shè)備對(duì)精密度的影響，結(jié)果各圖譜共有峰的相似度均達(dá)0.998以上，表明該方法中間精密度良好，隨機(jī)變動(dòng)因素不影響該方法精密度。

2.7.6 耐用性實(shí)驗(yàn) 取同一批皂角刺配方顆粒供試品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理樣品，分別使用Agilent Zorbax Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Dikma Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Welch Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)三種型號(hào)的色譜柱，按上述色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果在不同色譜柱因素變動(dòng)的條件下，各圖譜共有峰的相似度均達(dá)0.980以上，表明該方法耐用性良好。

3 討論

本研究對(duì)不同實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，考察了不同的流動(dòng)相體系，包括乙腈-0.5%磷酸，乙腈-0.1%磷酸，乙腈-水等；全波長(zhǎng)掃描考察了不同波長(zhǎng)下供試品的指紋圖譜。最終選取在203 nm下，乙腈-水梯度洗脫，該條件下譜圖色譜峰信息豐富，分離度好，穩(wěn)定性好，適合指紋圖譜研究要求。

根據(jù)相似度計(jì)算軟件得到10批皂角刺配方顆粒的對(duì)照?qǐng)D譜及各批樣品與對(duì)照?qǐng)D譜之間的相似度，結(jié)果均大于0.98，表明各批次樣品之間相關(guān)性較好，投料所用皂角刺原藥材質(zhì)量較穩(wěn)定，皂角刺配方顆粒工藝穩(wěn)定。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)中建立的采用HPLC法檢測(cè)皂角刺配方顆粒指紋圖譜方法的穩(wěn)定性、重復(fù)性好，為皂角刺配方顆粒質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供了參考。