正交試驗(yàn)和Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化五味子炮制工藝比較

劉炬灼，何 凡*，孫小玲

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.遼寧省藥品檢驗(yàn)檢測院，遼寧 沈陽 110031)

五味子是木蘭科植物五味子SchisandraeChinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實(shí)，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心的功效，用于久嗽虛喘、夢遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗盜汗、津傷口渴、內(nèi)熱消渴、心悸失眠等病癥的治療[1]，是臨床上生熟異用的代表藥之一。通過對(duì)五味子的傳統(tǒng)和現(xiàn)代文獻(xiàn)的查閱得知，五味子“入嗽藥生用，入補(bǔ)藥熟用”[2]，熟藥中產(chǎn)生作用的主要是木脂素類成分，炮制后，木脂素類成分普遍增加。在五味子中，木脂素類成分所占比例最高，因此本研究將木脂素類成分作為評(píng)價(jià)五味子炮制工藝優(yōu)劣的檢測指標(biāo)，進(jìn)一步優(yōu)化五味子的炮制工藝。

1 儀器與材料

1.1 試驗(yàn)藥物

五味子藥材購于遼寧光太藥業(yè)有限公司(生產(chǎn)許可證號(hào)：遼20150117，批號(hào)：20180301)；對(duì)照品五味子醇甲(批號(hào)：1116A023，純度≥98%)、五味子醇乙(批號(hào)：327A021，純度≥98%)、五味子甲素(批號(hào)：327B021，純度≥98%)、五味子乙素(批號(hào)：405A022，純度≥98%)、五味子丙素(批號(hào)：327A021，純度≥98%)、五味子酯甲(批號(hào)：327B021，純度≥98%)均購自北京索萊寶科技有限公司；五味子酯乙(批號(hào)：P07M6S1，純度≥98%)、五味子酚(批號(hào)：B21324，純度≥98%)均購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 試劑

甲醇、乙腈(色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；水為娃哈哈純凈水。

1.3 儀器

1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；超聲波清洗機(jī)(型號(hào)：JP-040S，深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司)；50克手提式高速萬能粉碎機(jī)(型號(hào)：DFT-50，溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；AR2140電子分析天平(上海奧豪斯公司)。

1.4 輔料

9°米醋(總酸度≥9.00 g/100 mL，江蘇恒順醋業(yè)股份有限公司)；陳釀黃酒(鎮(zhèn)江恒順酒業(yè)有限責(zé)任公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 木脂素類成分含量測定方法

2.1.1 色譜條件 Agela C18柱(博納艾杰爾科技有限公司，4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫，0～10 min，A：20%～55%；10～30 min，A：55%；30～40 min，A：55%～75%；40～50 min，A：75%～80%；VWD檢測器，檢測波長：217 nm；柱溫：30 ℃；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 取五味子各對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含五味子醇甲39.20 μg、五味子醇乙9.35 μg、五味子酯甲2.81 μg、五味子酯乙6.36 μg、五味子酚2.50 μg、五味子甲素16.31 μg、五味子乙素23.60 μg、五味子丙素3.47 μg的混合對(duì)照品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 取本品粉末(過三號(hào)篩)約0.25 g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加甲醇約20 mL，超聲處理(功率200 W，頻率40 kHz)20 min，取出，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 方法學(xué)考察

2.1.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液3、5、10、12、15、20 μL測定各色譜峰峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。結(jié)果見表1。

表1 8種成分的回歸方程及線性范圍

2.1.4.2 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，精密吸取10 μL，分別重復(fù)進(jìn)樣6次，測定并記錄峰面積，計(jì)算總木脂素含量，結(jié)果總木脂素含量的RSD小于2%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、12、24 h進(jìn)樣10 μL，測定并記錄峰面積，計(jì)算總木脂素含量，結(jié)果總木脂素的RSD小于2%，表明總木脂素在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份，分別按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下測定并記錄峰面積，計(jì)算總木脂素含量，結(jié)果總木脂素含量的RSD小于2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 采用加樣回收率的方法，取同一批樣品6份，精密稱定0.125 0 g，分別精密加入8種對(duì)照品溶液。按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下測定峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果表明8種木脂素平均加樣回收率為95%～102%，RSD小于2%，說明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.2 正交設(shè)計(jì)和BBD-RSM優(yōu)選五味子酒蒸和醋蒸炮制工藝

2.2.1 炮制方法 酒、醋蒸五味子：取凈五味子10 g，用黃酒或米醋拌勻，置于適宜容器內(nèi)，悶潤，隔水蒸制，表面顯紫黑色時(shí)取出，50 ℃烘11 h[3]。

2.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 參考文獻(xiàn)方法[4]，選用輔料用量(A)、悶潤時(shí)間(B)、蒸制時(shí)間(C)作為考察因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，以8種木脂素含量的總和為指標(biāo)，采用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)；BBD-RSM利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.3.1 正交試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果表明，各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響程度為A>B>C；方差分析結(jié)果表明，三種因素對(duì)酒制炮制工藝均沒有顯著影響(P>0.05)，最佳的酒制炮制工藝為A1B3C2，20(g/100 g)黃酒，悶潤2 h，蒸制時(shí)間為3 h取出，烘干。

表2 優(yōu)選五味子酒制工藝的正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

表3 優(yōu)選五味子醋制工藝的正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

結(jié)果表明，各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響程度為A>C>B；方差分析結(jié)果表明，因素A和因素C對(duì)炮制工藝有顯著影響，因素B沒有顯著影響，最佳的炮制工藝為A2B2C3，30 g/100 g米醋，悶潤1.5 h，蒸制5 h取出，烘干。

2.2.3.2 BBD-RSM試驗(yàn)結(jié)果

表4 BBD-RSM優(yōu)選五味子酒制工藝的因素水平及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表4 BBD-RSM優(yōu)選五味子酒制工藝的因素水平及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各因素經(jīng)回歸擬合后，得二次多項(xiàng)回歸方程為Y=-18.228 84+1.504 93A+23.397 10B-2.564 58C-0.622 61AB+0.412 19AC-0.497 15BC-0.035 437A2-1.483 45B2-0.924 56C2。通過方差分析模型具有顯著性；失擬項(xiàng)不顯著；多元相關(guān)系數(shù)R2=0.995 5，說明相關(guān)性越好；RAdj2=0.987 5和RPred2=0.944 5(RAdj2-RPred2<0.2)這兩個(gè)值高且接近，則回歸模型能充分說明工藝過程。C.V.%=1.32%<10%，表明實(shí)驗(yàn)的可信度和精確度高；Adeq Precision=37.959(精密度)>4，視為合理。所以擬合的回歸方程符合以上檢驗(yàn)原則，適應(yīng)性較好。此外，因素B、因素C、AB、AC的P<0.05，具有顯著性，各因素的影響大小依次為C>B>A。利用 Design-Expert 8.0.6軟件，根據(jù)擬合模型繪制三維曲線圖，見圖1、圖2、圖3，了解各因素的交互作用對(duì)總木脂素的影響。AB、AC交互作用顯著，BC交互作用不顯著。

圖1 酒的用量(A)與悶潤時(shí)間(B)的交互作用

圖2 酒的用量(A)與蒸制時(shí)間(C)的交互作用

圖3 悶潤時(shí)間(B)與蒸制時(shí)間(C)的交互作用

表5 BBD-RSM優(yōu)選五味子醋制工藝的因素水平及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各因素經(jīng)回歸擬合后，得二次多項(xiàng)回歸方程為Y=-43.29+1.101 23A+18.305 85B+16.982 82C+0.165 21AB-0.004 287 5AC-3.485 2BC-0.022 338A2-3.649 52B2-1.365 25C2。通過方差分析模型具有顯著性；失擬項(xiàng)不顯著；R2=0.992 8；RAdj2=0.979 8和RPred2=0.895 3(RAdj2-RPred2<0.2)；C.V.%=1.44%<10%；Adeq Precision=25.978>4。所以擬合的回歸方程符合以上檢驗(yàn)原則，適應(yīng)性較好。此外，因素B、因素C、AB、BC的P<0.05，具有顯著性，各因素的影響大小依次為B>C>A。利用 Design-Expert 8.0.6軟件，根據(jù)擬合模型繪制三維曲線圖，見圖4、圖5、圖6。結(jié)果表明，AB、BC交互作用較顯著，AC交互作用不顯著。

圖4 醋的用量(A)與悶潤時(shí)間(B)的交互作用

圖5 悶潤時(shí)間(B)與蒸制時(shí)間(C)的交互作用

圖6 醋的用量(A)與蒸制時(shí)間(C)的交互作用

2.2.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

表6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

BBD-RSM采用多元二次回歸方程擬合自變量與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，在對(duì)回歸方程進(jìn)行求解來找出最優(yōu)工藝參數(shù)的方法，可借助軟件Design-expert，獲得更多信息。正交設(shè)計(jì)以拉丁方的正交性為依據(jù)，進(jìn)行有選擇的試驗(yàn)，在解決多變量問題上應(yīng)用更久更廣泛，便于獲得最優(yōu)的因素組合和最佳試驗(yàn)結(jié)果[5-6]。其中五味子酒制工藝，正交試驗(yàn)結(jié)果顯示沒有顯著性因素，只能大概看出各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響趨勢；而BBD-RSM找出了具有顯著性的因素：悶潤時(shí)間、蒸制時(shí)間，且找出顯著性的交互作用：酒的用量與悶潤時(shí)間、酒的用量與蒸制時(shí)間。兩種設(shè)計(jì)方法最終所得總木脂素含量相接近，且正交試驗(yàn)中所得最佳工藝輔料用量和蒸制時(shí)間比BBD-RSM少，為節(jié)約成本，提高產(chǎn)量，故五味子酒制工藝最佳工藝為酒的用量20 g/100 g，悶潤時(shí)間2 h，蒸制時(shí)間3 h。關(guān)于五味子醋制工藝，BBD-RSM比正交試驗(yàn)得到的總木脂素含量高，且悶潤時(shí)間少了30 min，為提高產(chǎn)量，節(jié)約時(shí)間，故五味子醋制工藝最佳工藝為醋的用量30 g/100 g，悶潤時(shí)間1 h，蒸制時(shí)間5 h。