芪丹利心丸對心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠心肌纖維化的影響*

石斌豪，黃鈺婷，徐宗佩，樊官偉

（1.天津中醫藥大學，天津 301617；2.天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300193）

慢性心力衰竭（CHF）是由于心臟結構或功能異常導致心室充盈或射血能力受損的復雜臨床綜合征，以呼吸困難、乏力及液體潴留為主要表現。CHF的發病率不斷上升，急性心肌梗死是導致CHF 發病的主要疾病之一，而心肌纖維化是CHF 發病的主要原因之一，特別是心肌梗死導致的CHF 纖維化更加明顯[1-2]。轉化生長因子-β1（TGF-β1）已被證實在心肌纖維化中扮演著重要角色，通過介導TGF-β1/Smads 信號通路將心肌成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，持續促進細胞外基質（ECM）的沉積，導致心臟剛性增加、收縮舒張功能障礙[3]。

芪丹利心丸是天津中醫藥大學第一附屬醫院心內科防治慢性心力衰竭的專利方（專利號：ZL 201110413471.1），是基于CHF 中醫病因病機特點，依據益氣活血利水的治則創制，對于CHF 本虛標實、虛實夾雜的證候特點具有針對性，在臨床應用中有著良好療效[4]。利用益氣活血利水法治療CHF已有諸多報道[5-8]，在心力衰竭治療指南指導下聯合益氣活血利水方劑能提高心功能、緩解心力衰竭程度及心室重構，但對益氣活血利水中藥的作用機制研究尚不充分，本研究通過芪丹利心丸干預CHF 大鼠的實驗研究，以期闡釋其改善心功能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體（SPF）健康Sprague-Dawley 雄性大鼠120 只，體質量為220～240 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證編號：SCXK（京）2012-0001。

1.2 動物模型制備及分組 用5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，頸部及胸前備皮，腹部朝上，固定四肢及頭部。經口氣管插管連接小動物呼吸機輔助呼吸，胸前手術于第3、4 肋間打開胸腔，暴露心臟。于顯微鏡下確定左冠狀動脈前降支位置（肺動脈圓錐與左心耳交界處），進針深度約1.5 mm，結扎后心室前壁變蒼白，室壁運動明顯減弱。用棉球吸除胸腔內液體，擠出胸腔內氣體，逐層縫合肌肉及皮膚，觀察有自主呼吸后拔除插管。另設假手術組（Sham，10 只），在冠狀動脈前降支下只穿線不進行結扎。將冠狀動脈前降支結扎術后存活大鼠（86 只，術中死亡24 只）繼續飼養4 周后利用小動物超聲儀Vevo2100 測定左室射血分數（LVEF），以LVEF 0.38～0.50 為CHF 制模成功，CHF 模型成功率約52%（45 只），剔除未達到標準的大鼠后，按隨機數字表法將大鼠分為模型組（Model，術后給予等體積生理鹽水）、芪丹利心丸（天津中醫藥大學第一附屬醫院提供，每克藥粉相當于3.45 g 生藥）低[QD-L，1.1 g/（kg·d）]、中[QD-M，2.2 g/（kg·d）]、高[QD-H，4.4 g/（kg·d）] 劑量組和纈沙坦組[諾華制藥有限公司，Val，10 mg/（kg·d）]，各組均連續灌胃4 周。藥物干預后每組各剩余9 只。

1.3 觀察指標及方法

1.3.1 心動超聲及血流動力 給藥4 周后，各組隨機取6 只大鼠稱質量，異氟烷麻醉，仰臥位固定，利用超聲心動儀Vevo2100 及左心室壓力-容積環檢測大鼠LVEF、左室短軸縮短率（LVFS）、左室收縮末期內經（LVESD）、左室內壓上升或下降最大速率（±dp/dt max）等心臟功能指標。

1.3.2 蛋白組學指標檢測 將剩余大鼠（各組3 只）稱質量，異氟烷麻醉，仰臥位固定，在腹主動脈取血后，經腹主動脈用生理鹽水灌注沖洗，然后剪取大鼠心臟，除去心臟表面的血漬后用濾紙吸干水分稱質量，再根據不同實驗目的隨機每組各取3 只用于心臟病理觀察及相關蛋白組學指標檢測：1）取完整心臟組織置于4%多聚甲醛水溶液中固定，室溫保存備用于病理形態學實驗。2）取心臟組織包裹于錫箔紙放入凍存管中，液氮速凍30 min 后，轉存入-80 ℃冰箱保存，用于反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）和蛋白質免疫印跡實驗（Western Blot）。

1.3.2.1 病理組織觀察 將剪取的完整心臟置于4%多聚甲醛水溶液固定1 周，再經改刀，組織脫水，常規石蠟包埋，4 μm 切片，烤片；然后進行Masson染色。將石蠟切片梯度乙醇脫蠟至水，經鐵蘇木5 min、麗春紅酸性品紅5 min、磷鉬酸5 min、苯胺藍5 min、1%醋酸2 min，95%乙醇分化，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，按照標準操作規范，在倒置顯微鏡下觀察大鼠心肌纖維化情況。

1.3.2.2 用RT-PCR 檢測各組大鼠膠原蛋白（CollagenⅠ和Ⅲ）的mRNA 剪取大鼠心肌梗死邊緣區適量心臟組織，用TRIzol 法提取總RNA，然后通過反轉錄試劑盒將各組mRNA 反轉錄為cDNA。最后用RT-PCR 檢測目的基因mRNA 表達水平變化情況。所用引物由上海生物工程技術服務有限公司合成見表1。

表1 用于實時RT-PCR 的引物序列Tab.1 Primer sequences for real-time RT-PCR

1.3.2.3 用Western Blot 檢測各組大鼠TGF-β1/Smads 的蛋白表達 提取大鼠心臟組織蛋白，二喹啉甲酸法（BCA）試劑盒檢測各組大鼠心臟蛋白濃度，加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液并95 ℃水浴10 min，使蛋白變性，聚偏氟乙烯（PVDF）轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。一抗濃度為TGF-β1（1∶1 000，Proteintech，中國）、Smad3（1∶1 000，Proteintech，中國）、Smad7（1∶400，Boster，中國）、三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH，1 ∶1 000，Proteintech，中 國）。使 用VersaDoc 5000MP 多功能成像系統曝光成像，Quantity one 軟件進行圖像分析。

1.4 統計學方法 使用SPSS 22.0 統計軟件分析數據，符合正態分布的計量數據以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊采用LSD 法，若方差不齊采用Dunnett’s T3 法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 芪丹利心丸對心肌梗死后CHF 大鼠心功能的影響 超聲心動圖結果顯示（圖1、表2），模型組心室腔較假手術組明顯擴張。左心室心室律減弱，收縮功能發生障礙，而纈沙坦組和芪丹利心丸組上述情況明顯改善。與假手術組比較，模型組LVEF、LVFS、+dp/dt max 均顯著降低，室間隔厚度（IVST）明顯變薄，LVESD 顯著增厚，-dp/dt max 水平顯著升高。與模型組比較，纈沙坦組和芪丹利心丸組LVEF、LVFS、+dp/dt max 均升高，IVST 形態趨于正常，LVESD 顯著變薄，-dp/dt max 降低。結果提示芪丹利心丸能夠改善心功能、緩解心力衰竭大鼠心室重構進展，其中LVEF、LVFS、-dp/dt max 的改善以芪丹利心丸中劑量組效果更為明顯，而芪丹利心丸高劑量組改善IVST、LVESD、+dp/dt max 較其他給藥組效果更明顯。

圖1 心肌梗死后CHF 大鼠超聲心動圖Fig.1 Echocardiography of CHF rats after myocardial infarction

表2 各組大鼠心功能變化（x±s）Tab.2 Changes in cardiac function of each group of rats（x±s）

2.2 芪丹利心丸對心肌梗死后CHF 大鼠心肌纖維化的影響 Masson 染色顯示：心肌纖維呈紅色，膠原纖維呈藍色。假手術組心肌細胞排列整齊，細胞間質未見明顯藍色膠原纖維；模型組在心肌梗死邊緣區心肌細胞排列紊亂、心肌細胞肥大，有大量藍色膠原纖維沉積，梗死邊緣區纖維化面積較大；芪丹利心丸各組藍色膠原纖維多呈分枝狀分布，藍染面積較模型組都有不同程度的減少，尤以芪丹利心丸中劑量組較為顯著。說明芪丹利心丸具有降低心肌細胞纖維化的功能。見圖2。

2.3 芪丹利心丸對病理性心肌膠原蛋白沉積的影響 模型組CollagenⅠ和Ⅲ的mRNA 表達均較假手術組顯著升高，芪丹利心丸各組CollagenⅠ和Ⅲ的mRNA 表達較模型組顯著下降（P＜0.05），見圖3。

2.4 芪丹利心丸對TGF-β1/Smads 蛋白表達的影響 模型組TGF-β1 蛋白表達較假手術組顯著升高（P＜0.01），而芪丹利心丸各組TGF-β1 蛋白表達水平較模型組顯著降低（P＜0.05），并且芪丹利心丸明顯減少TGF-β1 下游信號分子Smad3 表達（P＜0.05），另一方面，提高抑制型蛋白Smad7 的表達，見圖4。

圖2 光鏡下各組心肌組織纖維化改變（×200）Fig.2 Changes in myocardial fibrosis in each group under light microscopy（×200）

3 討論

心肌損傷（如心肌梗死）往往會使未死亡的心肌細胞適應性改變和ECM 產生，導致心室的病理性重塑，心室收縮和舒張功能障礙[9]，主要病理特征為心室增大和LVEF 下降，且隨著時間的推移不斷惡化，LVEF 降低的心力衰竭是目前臨床主要常見心力衰竭類型[10]，另一方面，CHF 的中醫病機可以概括為：心氣虛—血瘀—水停—（心）陽虛（心氣虛加重），而且益氣活血利水法在臨床研究已被證實能提高臨床療效、LVEF、每搏輸出量、6 min 步行距離及患者生活質量；降低左室舒張末期內徑（LVEDD）、腦鈉肽（BNP）、N 末端前腦鈉肽（NT-proBNP）及C-反應蛋白（CRP）[11-16]，說明益氣活血利水藥物能起到改善心功能、延緩因心肌纖維化而導致心力衰竭惡化的作用。實驗結果也表明心肌梗死后CHF 大鼠LVEF、LVFS 明顯下降，心室腔擴大，收縮功能障礙，而芪丹利心丸可以改善模型大鼠心功能，緩解心室重構，對于心力衰竭患者可能更有針對性。

芪丹利心丸是以黃芪、黨參、丹參、葶藶子等益氣活血利水藥物化裁而成，黃芪、黨參為君補益脾、肺生化之氣，丹參活血化瘀為臣，另輔以葶藶子等利水養陰，臨床研究表明其具有改善心室重構的作用，但機制仍未明確。TGF-β1/Smads 在組織纖維化進展中扮演著重要角色，可涉及心、肺、肝、腎等組織纖維化病變[17-19]。其中，心肌梗死后死亡心肌細胞激活免疫反應，誘導細胞因子和趨化因子的表達，使中性粒細胞和單核細胞向梗死區域募集浸潤，激活巨噬細胞等保護機制，巨噬細胞能分泌TGF-β1、TGF-β1 與TGF-β 受體I 型和II 型結合，可激活TGF-β1/Smads 通路，促使心肌成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，在CHF 進展中持續產生ECM，Ⅲ型膠原增加并逐步被剛性Ⅰ型膠原逐漸取代[2]。本研究顯示，心肌梗死后CHF 大鼠纖維化水平明顯加劇，Ⅰ/Ⅲ型膠原沉積增加，尤其以Ⅰ型膠原顯著，心肌組織TGF-β1 蛋白水平升高，下游受體調節Smad3 升高，抑制型Smad7 降低，TGF-β1/Smads 與纖維化水平呈正比，說明心肌梗死后CHF 大鼠TGFβ1/Smads 處于激活狀態并持續促進ECM 沉積，而益氣活血利水中藥芪丹利心丸可能通過抑制TGF-β1/Smads 信號通路，降低TGF-β1 及下游信號Smad3表達，增強Smad7 的抑制作用，使病理性膠原合成減少，延緩心室重構，緩解慢性心力衰竭進展。

圖3 RT-PCR 檢測各組大鼠Collagen Ⅰ和Ⅲ的mRNA 表達水平Fig.3 RT-PCR detection of mRNA expression levels of Collagen I，III in each group

圖4 Western Blot 檢測各組大鼠TGF-β1/Smads 的蛋白表達Fig.4 Western Blot detection of protein expression of TGF-β1/Smads in each group

綜上所述，本研究表明芪丹利心丸對心肌纖維化進展有抑制作用，能延緩CHF 進程，對于LVEF降低的心力衰竭型患者可能效果更佳，益氣活血利水藥治療CHF 的進一步實驗或臨床研究仍有前景。