基于網絡藥理學的白花蛇舌草-半枝蓮藥對治療大腸癌的作用機制研究

王單單，郭麗娜，田會東，楊忠杰，王 瑞

（漯河市中心醫院臨床藥理科，漯河 462300）

大腸癌包括結腸癌和直腸癌，是常見的消化道惡性腫瘤，其發病率及病死率均較高[1]。目前，大腸癌的西醫治療手段以手術、放療及化療為主。現代藥理學研究表明中藥與化療聯用是綜合治療大腸癌的手段之一，能夠抑制腫瘤細胞的增殖，同時具有增效減毒及改善患者生存質量的作用[2]。

白花蛇舌草是以茜草科耳草屬植物1 a 生白花蛇舌草的干燥全草入藥，味苦、甘，性寒，可清熱解毒、利尿消腫[3]。半枝蓮為唇形科黃芩屬多年生草本植物，以全草入藥，味辛、苦，性寒，具有清熱解毒、化瘀利尿之功效[4]。兩者均為清熱解毒類中藥，具有清熱解毒、活血化瘀等功效，對腫瘤、炎癥療效確切，常以藥對形式出現在腫瘤和方、二半二白湯等各種治療腫瘤的臨床經驗方中[5]。研究發現半枝蓮提取物在體內外均可通過促進細胞凋亡及抑制腫瘤內部血管生成從而抑制結腸癌的發生發展，具有一定的抗結腸癌作用[6]。據報道白花蛇舌草乙醇提取物能夠抑制信號轉導及轉錄激活因子3（STAT3）信號通路從而促進人結腸腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的增殖[7]。晉小婷等[8]研究發現白花蛇舌草、半枝蓮醇提取物的混合物與單味藥醇提物相比能夠顯著抑制人結腸癌細胞株的生長，表明兩者配伍抗結腸癌作用會有所增強。近年來對白花蛇舌草及半枝蓮治療結腸癌的研究多集中在單一靶點及單一通路上[6-7]，然而中藥具有多成分、多靶點、多通路協同發揮藥效作用的特點，同時人體也是一種復雜的系統，故很難從單一方面闡述白花蛇舌草-半枝蓮藥對治療大腸癌的機制。

網絡藥理學是一種建立在計算機信息技術高速發展基礎上的研究中藥藥理新模式，其整合了系統生物學和多向藥理學的方法，通過對中藥成分、作用靶點以及涉及的生物通路進行分析，從而能夠系統闡明中藥產生藥效的物質基礎以及配伍規律等，利用網絡藥理學可闡明中藥活性成分及作用機制，預測中藥作用靶點，發現新的適應癥，從而增加中藥及其制劑的認可度和接受度[9]。本研究擬利用網絡藥理學方法，對白花蛇舌草-半枝蓮藥對治療大腸癌的主要物質基礎和配伍機制進行研究，以期為深入研究該藥對配伍治療結腸癌的科學內涵提供參考。

1 材料與方法

1.1 白花蛇舌草-半枝蓮成分篩選 利用中藥系統藥理分析平臺（TCMSP）[10]，以半枝蓮、白花蛇舌草兩味中藥為關鍵詞搜索出與這兩味中藥相關的全部化學成分。本研究以口服生物利用度（OB）化合物類藥性（DL）作為該藥對成分的篩選條件[11-12]，并結合文獻調研，最終確定本研究的候選化合物。

1.2 白花蛇舌草-半枝蓮藥對靶蛋白篩選 利用TCMSP 平臺查詢候選化合物的作用靶點。通過Uniprot 數據庫中的UniprotKB 查詢規范靶點名稱。

1.3 大腸癌疾病靶點的篩選 通過比較毒物基因組學數據庫（CTD），以“Colorectal cancer”為關鍵詞檢索與結腸癌相關的基因。

1.4 構建白花蛇舌草-半枝蓮藥對成分-靶點網絡 利用Cytoscape 3.6.1 軟件分析藥對成分-靶點關聯信息，構建出白花蛇舌草-半枝蓮藥對成分-靶點網絡圖，并分析候選化合物和靶蛋白間的度值（degree）。

1.5 構建蛋白質相互作用（PPI）網絡 通過構建蛋白質相互作用網絡可從生物化學和信號轉導角度出發研究候選化合物和疾病相關蛋白間的相互作用關系[13]。將藥對作用的靶點與大腸癌相關的靶蛋白的交集蛋白導入STRING 10.5 數據庫中獲取蛋白質相互作用信息，并得到蛋白質相互作用網絡圖。

1.6 核心靶點的通路分析 為了進一步分析上述篩選出的核心蛋白功能及在信號通路中的作用，將所得到白花蛇舌草－半枝蓮藥對治療大腸癌的靶點導入DAVID 數據庫，進行生物學過程富集分析（GO）和通路富集分析（KEGG）[14]。

1.7 成分-靶點-信號通路網絡構建 將交集蛋白與其相關聯的藥對中成分構建成與大腸癌相關的白花蛇舌草-半枝蓮藥對成分-靶點網絡圖。交集蛋白與KEGG 富集出的生物通路構建出大腸癌靶點－通路網絡圖。利用Cytoscape 3.6.1 軟件中的合并功能將以上2 種網絡合并，從而得出成分-靶點-信號通路網絡圖。

2 結果

2.1 活性化合物的篩選 利用TCMSP，檢索出半枝蓮包含化學成分94 種，白花蛇舌草包含化學成分37 種。通過OB 和DL 預測化學成分的成藥性，本研究基于樣本量以及文獻調研綜合考慮[15-16]，最終選擇OB≥30%與DL≥0.18 為篩選條件。結果顯示，半枝蓮中有29 種化學成分符合條件，白花蛇舌草有7 種化學成分符合條件，其中M98（槲皮素）、M359（谷甾醇）及M358（β-豆甾醇）為半枝蓮和白花蛇舌草的共有化學成分，共篩選出33 個候選化合物。“半枝蓮-白花蛇舌草”藥對中候選化合物的基本信息見表1。

2.2 白花蛇舌草-半枝蓮藥對成分-靶點網絡圖 將藥對篩選出的成分與靶點間關聯信息導入Cytoscape 3.6.1，從而得到成分-靶點網絡圖，見圖1。成分-靶點網絡圖中共有266 個節點和625 條邊，其中有30 個化合物節點用橙色正六邊形表示，236 個靶節點用綠色圓點表示。通過限定OB 值和DL 值共篩選出33 個候選化合物，但是化合物M2719、M1646、M1663 無相關靶點，故在成分-靶點網絡圖中只顯示了30 化合物靶點。在網絡中，1 個節點與其他節點相連接的邊越多，該節點的度值越高。度值高的節點在網絡中發揮樞紐作用，可能為該網絡的關鍵節點。在該網絡中，每個成分平均與20.83 個靶點存在相互作用，每個靶點平均與2.65 個成分相關聯，因此白花蛇舌草-半枝蓮藥對可通過多成分、多靶點發揮藥理作用。其中最多的化合物為M98 有151 個潛在靶點，其次是M6（木犀草素）有57 個靶點。這些度值較高的候選化合物，可能是“半枝蓮-白花蛇舌草”藥對發揮藥效的核心成分。具有較高度值的靶點為前列腺素G/H 合成酶1（PTGS1）、前列腺素G/H 合成酶2（PTGS2）、熱休克蛋白90（HSP90），具有較高度值的靶點可能是藥對發揮藥效的關鍵或者上游靶點。

2.3 白花蛇舌草-半枝蓮與大腸癌交集靶點 利用TCMSP 數據庫查詢出白花蛇舌草候選化合物181 個靶點，半枝蓮候選化合物230 個靶點，大腸癌403 個相關基因。通過在線韋恩圖得出半枝蓮、白花蛇舌草與大腸癌存在40 個共有基因，半枝蓮與大腸癌存在1 個共有基因。即白花蛇舌草-半枝蓮藥對候選化合物作用靶點與大腸癌共有41 個交集蛋白，見圖2。

2.4 白花蛇舌草-半枝蓮與大腸癌交集蛋白的PPI網絡圖構建 將“2.3 項”下得到的41 個交集蛋白導入STRING 10.5 數據庫中進行分析，從而得到PPI 網絡圖，見圖3。圖中有41 個節點，357 條邊，其中節點代表交集蛋白，邊則表示蛋白間的關聯作用，線條的粗細表示關聯度的大小，圖中節點的平均度值為8.7。

2.5 靶點通路分析 將41 個交集蛋白上傳至DAVID 中通過GO 功能富集分析得到284 個GO 條目（P＜0.05），其中包括生物過程（BP）229 個、細胞組成（CC）22 個、分子功能（MF）33 個，見圖4。

表1 白花蛇舌草-半枝蓮藥對33 個候選化合物基本信息Tab.1 Basic information of 33 candidate compounds in Hedyotis Diffusa-Scutellaria Barbat Herba

通過KEGG 通路富集篩選得到80 條信號通路（P＜0.05），前35 條顯示如圖5 所示。其中包括結腸癌信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、P53 信號通路、凋亡信號通路及炎癥性腸病等。

2.6 成分-靶點-信號通路網絡構建 整理大腸癌相關的成分靶點關聯信息以及相關靶點通路的關聯信息如表2、表3 所示，并將這些關聯信息上傳至Cytoscape 3.6.1 軟件中，并利用該軟件的合并功能構建白花蛇舌草-半枝蓮活性成分-作用靶點-信號通路網絡圖，如圖6 所示。圖中包括成分19 種，大腸癌相關靶點33 個，信號通路25 條。篩選出的該藥對候選活性成分的作用靶點分布在不同的信號通路，相互協調，通過調控不同的信號通路發揮治療大腸癌作用。

圖1 “半枝蓮-白花蛇舌草”成分-靶點網絡圖Fig.1 Compound-target network of Scutellaria Barbata-Hedyotis Diffusa

圖2 白花蛇舌草-半枝蓮與大腸癌相關交集基因韋恩圖Fig.2 Intersection gene of Hedyotis Diffusa-Scutellaria Barbat and colorectal cancer related target

圖3 “白花蛇舌草-半枝蓮”與大腸癌蛋白相互作用網絡圖Fig.3 Protein-protein interaction network diagram of Hedyotis Diffusa-Scutellaria Barba and colorectal cancer

圖4 白花蛇舌草-半枝蓮靶標的GO 富集分析圖Fig.4 GO enrichment analysis of targets of Hedyotis Diffusa-Scutellaria Barba

圖5 白花蛇舌草-半枝蓮治療大腸癌相關靶蛋白KEGG富集分析的35 條通路圖Fig.5 Thirty five channels of analysis of KEGG concentration in treatment of colorectal cancer by Hedyotis Diffusa-Scutellaria Barbata

表2 大腸癌相關活性成分-靶點關聯信息Tab.2 Correlation information of colorectal cancer related components-target

表3 大腸癌靶點關聯信號通路信息Tab.3 Correlation information of colorectal cancer related target-pathway

3 討論

大腸癌是一種受多種因素影響的系統性疾病，其發生發展過程由多種信號分子和多條生物通路調控，由于大腸癌發病機制的高度復雜性，從而單一分子單一靶點的治療策略很難取得滿意的效果。本研究利用網絡藥理學方法，通過分析半枝蓮-白花蛇舌草藥對所包含的成分、作用靶點及調控的信號通路，建立該藥對治療大腸癌的“成分-靶點-信號通路”多層次網絡模型，從整體角度出發研究半枝蓮-白花蛇舌草藥對發揮治療大腸癌作用的主要物質基礎和藥理機制。

圖6 白花蛇舌草-半枝蓮治療大腸癌成分-靶點-信號通路Fig.6 Compounds-targets-pathway network of Hedyotis Diffusa-Scutellaria Barba

本研究運用網絡藥理學技術預測到白花蛇舌草-半枝蓮藥對治療大腸癌的19 個活性成分、33 個潛在作用靶點以及25 條信號通路，該藥對治療大腸癌成分、靶點及信號通路的多樣性也在一定程度上體現了中藥治療疾病的整體性和系統性。通過分析成分-靶點-信號通路網絡圖，槲皮素、木犀草素、黃芩素、漢黃芩苷及β-谷甾醇在網絡中的關聯度較高，這幾種成分可能是白花蛇舌草、半枝蓮治療大腸癌的物質基礎。據報道關聯度較高的前5 種化合物均有顯著的抗大腸癌作用[17-21]，槲皮素可通過抑制細胞周期、增加細胞凋亡、抑制血管生成和轉移等多種機制發揮抗結腸癌作用[17]；黃芩素通過抑制蛋白激酶B（AKT）信號通路降低基質金屬蛋白酶2（MMP-2）和基質金屬蛋白酶9（MMP-9）的表達，從而抑制結直腸癌細胞遷移和侵襲[19]。靶點AKT1、腫瘤抑制蛋白（TP53）、MMP-2、MMP-9、腫瘤壞死因子（TNF）及前列腺素內源性過氧化物合酶（PTGS2）在網絡的中心位置可能為白花蛇舌草、半枝蓮治療大腸癌的潛在靶點，這些靶點涉及凋亡、細胞周期、免疫系統，這些生物過程與大腸癌的發生發展密切相關，進一步印證了白花蛇舌草、半枝蓮藥對具有治療大腸癌的作用。其中靶點MMP-2、MMP-9 是參與腫瘤細胞遷移侵襲和轉移的主要蛋白水解酶，研究表明MMP-2、MMP-9 的表達會影響結腸癌細胞的浸潤和轉移[22]。前列腺素合成的主要限速酶PTGS2，在心血管疾病、炎癥、腫瘤中都發揮重要作用[23]。在炎癥及促有絲分裂的刺激下會誘導PTGS2 的表達，進而參與前列腺素E2的表達，前列腺素E2可參與腫瘤細胞的增殖、血管生成及侵襲等多種生物過程[24]。臨床研究表明，在大腸癌早期治療中選擇性PTGS2抑制劑具有較顯著的抗腫瘤作用[25]。通過GO 基因分析和KEGG 通路富集分析表明白花蛇舌草、半枝蓮藥對通過促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖分化及增強機體免疫等多種途徑發揮抗大腸癌的作用，體現了中藥治療疾病的整體性與系統性。

本研究從網絡藥理學角度出發，初步闡述了白花蛇舌草-半枝蓮治療大腸癌的潛在活性成分、可能作用的靶點及發揮藥效的關鍵生物學通路，為進一步的實驗驗證研究奠定了良好的基礎。當然，本研究也存在一定的局限性，由于篇幅有限只是通過挖掘數據對白花蛇舌草-半枝蓮治療大腸癌的藥理作用機制進行預測，忽略了各成分含量、化合物間相互作用及藥物體內代謝過程的影響，還需要進一步通過藥理和臨床研究驗證。