重組人骨形態發生蛋白10的表達純化及其心臟保護功能

王若璋, 金 堅

(江南大學 藥學院, 江蘇 無錫, 214122)

2003年的流行病學統計結果[1-3]顯示，中國成人(35～74歲)的心力衰竭(心衰)患病率約為0.9%, 已成為65歲以上患病人群住院的首要原因。病毒性心肌炎、高血壓、缺血性心臟病、使用具有心臟毒性的藥物等因素均可導致心衰的發生。心衰的病理進展包括心肌細胞的死亡、成纖維細胞的募集和細胞外基質的沉積，最終可導致心臟功能的嚴重損傷[4-7]。目前研究[4-5, 8]認為，心肌細胞的死亡對心力衰竭的發展具有關鍵的影響。采取措施預防或拮抗心肌細胞死亡是阻止或減慢心力衰竭進展的關鍵。

多柔比星(DOX)是一種經典的蒽環類抗腫瘤化療藥物，可用于治療實體瘤和血液系統腫瘤[6]。20世紀60年代，隨著蒽環類抗生素在腫瘤臨床治療中的使用，人們第一次意識到化療過程可能對心臟功能產生影響[9-11]。DOX介導的心臟毒性的機制被認為主要與自由基產生、線粒體功能障礙、DNA損傷和肌原纖維變性等因素有關[12]。DOX的使用可引起充血性心力衰竭、左室射血分數的下降、高血壓、心律失常、QTC期延長以及心肌缺血等現象，造成可逆或不可逆的心臟損傷[13]。

骨形態發生蛋白10(BMP10)是一種腫瘤壞死因子-β(TGF-β)超家族的分泌型細胞外信號多肽，在哺乳動物胚胎心臟發育過程中起到關鍵作用[14-16]。BMP10的表達可以在特定的心臟病理情況下被重新激活[16]。為了研究BMP10在成年動物心臟中的作用，作者前期研究構建了條件型轉基因小鼠模型，發現BMP10在成年動物心臟中的過表達可以有效降低β-腎上腺素類似物長期過度刺激引起的心肌細胞死亡，并保護受損心臟。此外，BMP10通過旁分泌的方式來發揮其作用，這一特性賦予了其全身給藥的能力。

在這項研究中，作者制備了一種關鍵的心源性生長因子BMP10, 并測試其是否可以減輕由DOX誘導的心臟損傷。作者研究證明，在注射DOX后，與使用生理鹽水處理的野生型小鼠相比, BMP10處理小鼠具有更好的心臟功能，證明BMP10可以有效地保護心臟免受DOX介導的心臟毒性影響，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

CHO-S細胞株為本實驗室留存細胞株, C2C12細胞株購自ATCC。高保真酶, Takara; DMEM/F12培養基，胎牛血清, G418, DMEM等, Gibco; M2/M4 CHO無血清培養基, Feed4補料培養基，蘇州康聚生物有限公司; anti-BMP10 antibody, R&D; Dual luciferase reporter assay system, Promega。

1.2 實驗方法

1.2.1 表達質粒構建: 通過融合PCR的方法除去重組人BMP10(rhBMP10) cDNA序列中的EcoRI識別位點(GAATTC), 突變后的序列為GAGTTC, 不影響其編碼的氨基酸序列和翻譯效率。修改后的cDNA被EcoRI和Not I酶切，并使用T4連接酶插入到pMH3質粒中。融合PCR所使用的引物和PCR程序見表1。

1.2.2 CHO-BMP10細胞株構建: 取懸浮培養的狀態良好的CHO-S細胞，計數，取約3.0×106cells/mL細胞，離心，用200 μL PBS重懸，加入40 μg質粒和10 μg Salmon sperm混勻，將電轉體系加入預冷的2 mm電擊杯中，置冰上5 min, 160 V, 15 ms電擊共3次。取2個100 mm dish, 分別加入10 mL D/F完全培養基，將電擊后的體系均勻分至2個dish中，置于濕式二氧化碳培養箱靜置培養(37 ℃, 5% CO2)。

表1 融合PCR引物

CHO-S轉染第2天，換液，加入終濃度為4.5 mg/mL的G418進行壓力篩選，靜置培養約10 d。取96孔板，每孔加入200 μL D/F完全培養基。取壓力篩選后，生長出克隆的dish, 用10 μL tip挑取克隆，并轉移至96孔板中。約1周后，鏡檢可觀察到明顯克隆，棄上清，加入100 μL D/F基礎培養基, 2 d后取上清，Dot blot檢測BMP10表達水平，選取高表達的3個克隆，使用dish擴大培養后，再挑去克隆至96孔板中，重復上述步驟，共3次。最后，取表達量最高的1株細胞，稀釋至約3.5 cells/mL, 每孔200 μL鋪96孔板，選擇單克隆，擴大培養并凍存，命名為CHO-BMP10細胞系。

1.2.3 CHO-BMP10流加培養: 將CHO-BMP10細胞株懸浮馴化，將生長狀態良好的種子接種于250 mL搖瓶中，密度為1.0×106cells/mL, 體積150 mL, 100 轉/min, 37 ℃培養。至密度為(5.0～6.0)×106cells/mL時，將二級種子接入3 L搖瓶中, 100轉/min, 37 ℃培養。根據生長情況將培養體積逐漸補充至1.5 L, 停止補加培養基后，待細胞密度上升至(9.0～10.0)×106cells/mL時，降溫至34 ℃培養。根據葡萄糖濃度添加Feed 4補料培養基，維持體系中葡萄糖的濃度在3 g/L左右。至細胞直徑≥16 μm時，密切關注細胞活率，當活率突然下降時(90%左右)，結束培養。

1.2.4 純化: 將5 L培養上清8 000轉/min離心30 min。用0.22 μm微孔濾膜過濾上清，然后使用Millipore Pellicon超濾系統和10 kDa膜包進行緩沖液置換。將體積超濾濃縮至500 mL, 然后加入50 mmol/L苯丁酸鈉(NaPB) 4.5 L , 超濾濃縮至500 mL, 然后再加入50 mmol/L NaPB 4.5 L , 超濾濃縮至500 mL。

將3個5 mL HiTrap Q HP柱串聯，接入AKTA avant 25。所使用的流動相中, A液為50 mmol/L NaPB, B液為1 mol/L 氯化鈉(NaCl), 系統流速為1 mL/min。用A液沖平UV280, 調零后上樣，然后用A液淋洗，直至沖平UV280, 用25% B液洗脫并收集洗脫峰。

用10 kDa超濾管將Q柱純化產物濃縮。Loop環上樣至采用50 mmol/L NaPB+150 mmol/L NaCl平衡過的Superdex 200 10/300色譜柱上，并收集洗脫峰。所使用的流動相為50 mmol/L NaPB+150 mmol/L NaCl, 系統流速為0.5 mL/min。

1.2.5 蛋白電泳: CHO細胞的培養上清或純化后的蛋白，適當稀釋后，加入不含還原劑的5× Loading Buffer, 常規制樣，并使用4%～20%梯度膠板進行電泳。根據需要進行考馬斯亮藍染色或Western blot。

1.2.6 熒光素酶報告檢測: 取C2C12細胞鋪24孔板，每孔7×104cells。培養過夜后，轉染pGL6質粒, 6 h后換液，每孔加入適當稀釋的BMP10標準品或樣品，培養12 h, 用PBS洗滌1次，棄上清，按照試劑盒說明書進行檢測。

1.2.7 動物模型構建: 70只雄性健康C57BL/6J小鼠被隨機分為4組，其中2組為每組15只(Saline組, rhBMP10組)，其他2組為每組20只(DOX組, DOX +rhBMP10組)。在實驗開始前3 d, Saline組、DOX組每天注射PBS 200 μL; rhBMP10組、DOX+rhBMP10組每天注射200 μL rhBMP10 (2 μg), 直至第5周結束。Saline組、rhBMP10組每周注射1次PBS，共5次; DOX組、DOX+rhBMP10組每周注射1次DOX(5 mg/kg), 共5次[17]。第5周結束后，每組隨機選取4只動物檢測超聲心動圖; 隨后處死動物，分離血清檢測血清心肌肌鈣蛋白和肌紅蛋白水平; 取心臟組織切片并使用TUNEL法檢測心肌細胞凋亡水平。

1.2.8 超聲心動圖: 采用Visual Sonics公司的Vevo 2100小動物超聲系統，在第5周實驗結束后進行超聲心動圖檢測。使用Vaporizer霧化罐，將小鼠置于密閉透明亞克力箱中，使其吸入異氟烷麻醉，在小鼠左胸涂抹適量脫毛膏，稍等片刻后用濕棉球擦去毛發。采用仰臥位將小鼠固定至恒溫手術臺，套上異氟烷呼吸面罩。固定四肢以采集心電及呼吸信號，待心率穩定后在左胸涂抹耦合劑，接入探頭采集數據。選取短軸切面進行采集。自B mode超聲心動圖中截取M mode超聲，并以此為基礎計算短軸縮短率(FS)。

1.2.9 TUNEL: 取小鼠心臟組織，常規脫水包埋，并切片。常規脫蠟至水，用索萊寶TUNEL試劑進行檢測。

1.3 統計學分析

數據以均數±標準差表示，行t檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 CHO-BMP10細胞株的構建

將構建好的pMH3質粒電轉染至CHO-S空細胞，并加入終濃度為4.5 mg/mL的G418壓力篩選。約10 d后，可在dish底部觀察到肉眼可見的白色半透明細胞克隆。將克隆挑至96孔板并培養至圓形克隆長出后，換用D/F基礎培養基培養2 d, 并用Dot blot檢測上清中rhBMP10的表達水平。第1次克隆檢測中(圖1A), 背景較深，一方面說明rhBMP10的表達水平較低，另一方面說明單孔中的細胞為非單一來源細胞，有一定比例的細胞不能表達rhBMP10。第2次克隆中(圖1B), rhBMP10的表達水平呈上升趨勢。選取第2次克隆中表達最高的3個孔，將細胞消化、擴大培養后，用有限稀釋法接種至96孔板，待克隆長出后再次進行Dot blot檢測(圖1C)。選取表達量最高的孔，擴大至24孔板培養并再次檢測，將表達量最高的細胞株擴大培養并凍存，得到穩定表達rhBMP10的CHO-S工程細胞株CHO-BMP10。

2.2 rhBMP10的流加培養

細胞在0～3 d呈現快速增長狀態，此時細胞處于對數增長期，細胞增殖旺盛，存活率高且細胞直徑小。在4 d開始進行補料，同時將培養溫度下調至34 ℃, 以延長平臺期，維持細胞的高密度生長狀態。由于養分的消耗和空間的擠占，細胞生長速度下降，活率也緩慢下降，最終在8 d達到最大密度(9.1×106cells/mL)。從第3天開始，細胞直徑逐步增大，到第9天達到16.4 μm, 提示細胞衰老，同時存活率下降至94.0%, 故選擇在第10天結束培養。見圖2。

取樣進行Western blot, 由圖3可以看出, rhBMP10隨著培養時間的增加逐步積累，同時呈現多條帶的特征。其中116 kDa的條帶在1～2 d較少，隨后逐漸增多; 68 kDa和55 kDa的條帶則在3 d開始積累，而位于26 kDa的成熟rhBMP10生長因子結構域二聚體則在7 d開始出現，表明CHO表達體系缺乏相關的酶切體系，不足以處理rhBMP10中存在的RIRR↓316酶切位點。

A: 第1次克隆篩選結果; B: 第2次克隆篩選結果; C: 單克隆化后的表達情況圖1 rhBMP10表達細胞株構建免疫印跡圖

A: 細胞存活率; B: 細胞密度; C: 細胞直徑圖2 CHO-BMP10細胞株在3 L搖瓶流加培養過程中的生長情況

圖3 CHO-BMP10細胞株在3 L搖瓶流加培養過程中的產物累積情況(Western blot)

對結束培養時的表達上清進行ELISA定量分析，結束培養時的rhBMP10產量為35.3 mg/L。

2.3 rhBMP10的純化

本研究分別使用Q柱和分子篩對所表達的rhBMP10進行了純化。Q柱純化中，洗脫峰的考馬斯亮藍染色結果呈現多條帶的特征，主要包括116 kDa、68 kDa、43 kDa、26 kDa這4個條帶。在分子篩純化中，上述4個條帶亦未被分離。對純化后的表達上清進行ELISA定量分析，獲得的純化rhBMP10純度≥95%, 濃度為4.5 mg/mL, 體積為15.3 mL, rhBMP10總產量為68.85 mg, 收率為49.8%。見圖4、5。

2.4 熒光素酶報告活性檢測

能夠被BMP家族成員特異性激活的核酸序列被稱為BMP反應區段(BRE)。將BRE序列整合到Minimal TA promoter前，在BMP10的存在下，便可以特異性地啟動其下游編碼蛋白的轉錄。作者構建了包含BRE元件的pGL6螢火蟲熒光素酶報告質粒，將其穩定轉染至C2C12細胞中，并利用這種方法對BMP10的生物活性進行體外檢測。

在作者構建的C2C12報告細胞株中，血清會對報告系統造成比較大的影響。培養基中0%、0.1%。1%、2%、5%、10%的胎牛血清(FBS)分別可以導致(1 326±200)、(3 495±270)、(10 692±1 414)、(21 933± 1 615)、(42 816±3 269)、(73 792±4 601)相對熒光素酶單位(RLU)的非特異性信號。因此將檢測過程的培養基血清含量降低至0.1%, 以保證較高的信噪比。

檢測過程中使用濃度10 ng/mL的rhBMP10來測定rhBMP10的生物活性。未轉染質粒的空白對照、加入CHO-S空細胞培養上清、TGF-β或是PBS的C2C12細胞幾乎不表達螢火蟲熒光素酶，其信號值依次為(22±9)、(2 652±405)、(3 585±297)、(3 315±366) RLU，說明該檢測系統的特異性較好，噪音值較低。從R&D購買的BMP10 GFD二聚體在10 ng/mL濃度時的信號值為(67 640±8 535) RLU。同等濃度下, CHO-BMP10表達并純化的rhBMP10可以誘導表達(86 367±2 685) RLU, 證實CHO-BMP10表達并純化的rhBMP10具有很好的生物活性。

A: Q柱純化色譜圖(UV280); B: Q柱純化色譜圖(B液比例); C: Gel filtration柱純化運行圖譜圖4 rhBMP10的純化結果圖

A: Q柱純化收集洗脫峰的考馬斯亮藍染色圖, rhBMP10為含有250 mmol/L NaCl的50 mmol/L NaPB洗脫峰, BMP10(R&D)為從R&D公司購買的對照品; B: Gel filtration柱純化收集洗脫峰的考馬斯亮藍染色圖, 1為～12 mL洗脫峰,2為～19 mL洗脫峰。圖5 收集洗脫峰的考馬斯亮藍染色圖

2.5 超聲心動圖

為了評價多柔比星對小鼠心臟收縮和舒張功能的損傷，作者使用經胸廓超聲心動圖來檢測小鼠的心功能(n=4)。通過使用超高頻率的超聲探頭，并配合M mode超聲，可以無損地對小鼠的左室功能進行定量分析。與Saline組相比，DOX模型組的小鼠心臟功能出現了明顯下降，其短軸縮短率為(40.4±2.8)%, 較Saline組(58.0±2.8)%出現了顯著下降(P<0.01), 提示多柔比星模型組小鼠心肌的收縮功能受損，心功能下降。在rhBMP10組(52.7±2.9)%和DOX+rhBMP10聯合給藥組(52.6±4.1)%小鼠的超聲結果中，小鼠的心臟功能與Saline組相比差異無顯著性。見圖6。

圖6 超聲心動圖檢查結果

2.6 血清心肌損傷標志物檢測

在DOX處理組中，小鼠血清中的心肌肌鈣蛋白I(cTnI)和肌紅蛋白(Mb)水平分別為(138.5±23.8)、(292.2±20.4) ng/mL, 顯著高于Saline組中的(98.8±5.9)、(157.9±19.2) ng/mL和rhBMP10組中的(112.3±5.8)、(150.9±40.3) ng/mL, 提示心肌細胞受損。而DOX+rhBMP10組小鼠中, cTnI和Mb水平分別為(106.7±8.0)、(175.4±21.8) ng/mL。見表2。

表2 各組血清心肌肌鈣蛋白Ⅰ、肌紅蛋白水平比較

cTnI: 心肌肌鈣蛋白Ⅰ; Mb: 肌紅蛋白。與DOX組比較, *P<0.05, **P<0.01。

2.7 TUNEL

TUNEL檢測中, DOX組小鼠的心臟凋亡比例顯著上升(P<0.01), 達到(0.236±0.082)%, 高于DOX+rhBMP10組(0.038±0.028)%和Saline組(0.011±0.020)%。在rhBMP10對照組中，心肌細胞的凋亡比例為(0.022±0.022)%。見圖7。

圖7 TUNEL檢測結果圖(標尺20 μm)

3 討 論

骨形態發生蛋白(BMP)屬于TGF-β超家族。BMP的所有成員在蛋白質序列中具有獨特的同一性，并且具有相似的蛋白質結構，但具有不同的組織分布和生物學功能。在心臟中發現了6個BMP成員的表達，其中包括BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7和BMP10, 且已被證明參與了心臟發育的多個步驟。BMP10的表達主要存在于心臟[15]。BMP2和BMP4的表達較為廣泛，并參與心源性誘導和心內膜墊形成[15, 18]。

研究[19]顯示, BMP5、BMP6和BMP7在早期心臟發育中調節心室壁和腔室形成。已知BMP10可在某些心臟病發病條件下重新激活[16], 但BMP10在出生后心臟中的生物學功能尚不清楚。通常情況下, BMP通過與Ⅰ型和Ⅱ型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結合，磷酸化Smad1/5/8蛋白并發揮其生物學活性[20-21]。作者的前期研究表明，出生后心臟中BMP10的轉基因過表達顯著降低了心肌細胞肥大性生長，同時不影響運動誘導的心臟肥大和對β-腎上腺素能激動劑異丙腎上腺素的肥大反應(即模擬病理性肥大)。這些研究表明BMP10可能是一種心臟保護試劑。

本研究中，作者制備了具有高生物活性的rhBMP10蛋白，通過高劑量、多次的多柔比星注射構建了多柔比星誘導的小鼠心臟病模型，并證明了rhBMP10的使用可以減輕多柔比星引起的心功能下降、心肌細胞損傷和凋亡。通過分析rhBMP10對多柔比星介導的心臟毒性的影響，進一步證實了BMP10在心臟保護方面的積極意義。