抗阻運動對力竭游泳小鼠動脈粥樣硬化易損斑塊的影響

王瑤 馬駿 楊豐 張群輝 鐘俊達， 黃建玉 郭丹霞， 姜文才 徐琳

1廣州中醫藥大學研究生院（廣州510403）；2中國人民解放軍南部戰區總醫院心血管內科（廣州510010）；3南方醫科大學（廣州510515）

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（coronary heart disease，CHD）已成為危害人類健康的“頭號殺手”，最新數據表明CHD 病死率增長迅猛，與10年前相比，城市增加1.63 倍，農村增加3.98 倍。其中急性冠脈事件發病兇險，嚴重威脅人們的生命［1］。研究［2-3］顯示，約70%的急性冠脈事件是由動脈粥樣硬化斑塊破裂引起的，易損斑塊是罪魁禍首［4］。

力竭運動是疲勞長期積累而引起機體功能紊亂的病理狀態。力竭運動時機體血液中的兒茶酚胺水平升高，心臟負荷加重，同時機體水分蒸發快、血液黏稠度增高、血管內皮損傷，易出現血小板聚集和血栓形成，引起心肌嚴重缺血，甚至導致猝死［5-6］。然而力竭運動是否直接誘導易損斑塊破裂還未得到證實。

CHD 是內外因共同作用的復雜過程，離不開長期慢性炎癥累積，抗阻運動在CHD 防治方面已被證實有一定成效，研究［7-8］表明抗阻運動可增加骨骼肌質量和力量，提高基礎代謝率，加強運動耐力，通過降低血清炎癥因子水平改善機體的慢性炎癥狀態。但抗阻運動對易損斑塊的影響尚不知曉。本研究探討力竭游泳運動誘導易損斑塊破裂，抗阻運動對易損斑塊穩定性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物8周齡SPF級C57BL/6J背景ApoE-/-雄性小鼠30 只，體質量18～22 g，購自南京大學-南京生物醫藥研究院，許可證號SCXK（蘇）2015-0001，飼養于南部戰區總醫院（原廣州軍區廣州總醫院）動物實驗中心，室溫22～24 ℃，相對濕度50%，光照時間7：00～19：00，適應性喂養1 周，高脂飲食（主要成分0.15%膽固醇、21%脂肪和15.5%蛋白質），購自廣東省醫學實驗動物中心，本實驗通過實驗動物倫理委員會批準，符合實驗動物倫理和實驗動物福利。

1.2 實驗過程

1.2.1 實驗動物模型全部ApoE-/-雄性小鼠適應性高脂喂養1 周后行左側頸總動脈套管術，腹腔麻醉（3%戊巴比妥，2 mL/kg），于氣管旁找到左側頸總動脈，小心分離，套入硅膠管，實驗全程高脂飲食飼養。

1.2.2 力竭運動的實施力竭游泳運動采用水迷宮作為小鼠游泳槽，內壁光滑，水溫控制在（32 ±2）℃之間，室溫控制在21～23 ℃，相對濕度40%～60%，水深為小鼠（身長+尾長）×1.5 倍，小鼠尾部負重2%的體質量負荷。正式實驗前1 天進行1 次熱身運動以適應游泳。

力竭標準：小鼠連續3 次沉入水底，每次超過5 s，不能自主浮上水面；同時觀察小鼠身體狀況，當出現協調運動喪失，放在平面上無法完成翻正反射時即從水中撈出。每次游泳運動結束后均擦除水分，并使用吹風機吹干皮毛。每次游泳至力竭標準。力竭游泳運動共進行14 d，1 次/d，于最后1 次力竭游泳運動后即刻取材。

1.2.3 抗阻運動的實施參考過往文獻報道［9，12］的方法，ApoE-/-小鼠頸動脈套管術后于第10 周齡開始進行7 d 漸進性遞增負荷的爬梯訓練。爬梯高為1.1 m，間隔為2 cm，傾斜角度為85°。第一周為適應性訓練，以不負重起始，每天以10%體質量的負荷遞增（負荷使用橡皮泥綁在小鼠尾巴根部），終負荷為體質量的70%，每天進行兩組，每組重復3 次，組內休息1 min，組間休息2 min，5 d/周，持續8 周。

1.2.4 動物分組及處理將ApoE-/-小鼠稱重后，小鼠的體質量為（22.93± 1.26）g，隨機分為對照組（Ctl 組）、力竭組（Exh 組）、抗阻+力竭組（Res+Exh組），分組完成后，打耳標，Ctl 組編號1、2、3、4……；Exh 組11、12、13、14……；Res+Exh 組21、22、23、24、25……。全程高脂喂養，全部小鼠行頸總動脈套管術，Ctl 組正常活動10 周，術后Exh 組先正常活動8 周再進行2 周力竭游泳運動，Res+Exh 組先進行8 周抗阻運動再進行2 周力竭游泳運動。結束后取血，標本離心取上清；冰生理鹽水、4%多聚甲醛心臟灌流取出頸總動脈，4%多聚甲醛固定，分別石蠟包埋和冰凍切片。頸總動脈段剪下，生理鹽水清洗，迅速置液氮速凍，后轉移至-80 ℃冰箱保存。

1.3 組織病理學和免疫組織化學從石蠟包埋的頸總動脈根部起始制成5 μm 厚度連續切片，行HE 染色觀察斑塊大小及纖維帽厚度、Masson 染色觀察膠原成分。冰凍切片上行油紅O 染色觀察脂質沉積，免疫組化檢測巨噬細胞、平滑肌細胞在局部的表達。光學顯微鏡下觀察其病理形態。利用IPP 圖像分析系統，計算斑塊面積大小、纖維帽厚度和易損指數［易損指數=（巨噬細胞+脂質）面積陽性%/（平滑肌細胞+膠原）面積陽性%］。

1.4 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）用ELISA 試劑盒檢測血清血脂水平總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）濃度。

1.5 統計學方法數據的統計采用SPSS 21.0（IBM 公司，美國）和GraphPad Prism 7 統計軟件處理。計量資料以表示，計數資料以率或構成比表示。K-S 檢驗對數據進行正態性分析，數據呈正態分布，3 組組間比較比較用方差分析，兩兩比較用SNK 法，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠實施力竭運動和抗阻運動與Ctl 組相比，體質量、血脂水平、病理免疫組化檢測指標的變化情況實驗后3 組的體質量均上升，其中Res+Exh 組上升幅度最小；血脂水平抗阻運動得到改善；病理學檢測結果力竭運動對斑塊破裂影響最大，而抗阻運動對其有減少作用。見表1。

抗阻運動和力竭游泳運動開始前，3 組小鼠的體質量均為（22.93 ± 1.26）g，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。高脂飲食后3組體質量均上升，Ctl組（27.46±1.59）g上升最明顯，Res+Exh組（25.74 ± 0.75）g 上 升 幅 度 小 于Exh 組（27.46 ±1.59）g，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 頸總動脈斑塊面積大小、纖維帽厚度、脂質沉積、膠原成分的比較頸動脈石蠟切片HE 染色病理結果顯示，Ctl 組無斑塊形成，Exh 組斑塊面積最大。見圖1。

斑塊大小、纖維帽厚度、脂質沉積和膠原成分3 組比較，斑塊大小Ctl 組（131.12 ± 2.91）μm2，Exh組（178.94 ± 3.74）μm2，Res+Exh 組（94.84 ± 3.74）μm2，Exh 組斑 塊 面積大于Ctl 組和Res+Exh 組，Res+Exh 組最小，差異有統計學意義（P＜0.001）。Exh 組纖維帽厚度（1.31 ± 0.04）μm 比Ctl 組（3.07± 0.12）μm 和Res+Exh 組（5.65 ± 0.25）μm 薄，Res+Exh 組的纖維帽最厚（P＜0.05）。Exh 組（57.56 ±1.12）%膠原 成分 少 于Ctl 組（65.47 ± 0.69）%和Res+Exh 組（69.57 ± 0.64）%，脂 質 沉 積Exh 組（17.29 ± 1.2）%大于Ctl 組（15.37 ± 1.59）%和Res+Exh 組（13.01±0.97）%，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 3 組體質量、病理指標、血脂水平情況Tab.1 Three groups of body mass，pathological indicators，blood lipid levels ±s

表1 3 組體質量、病理指標、血脂水平情況Tab.1 Three groups of body mass，pathological indicators，blood lipid levels ±s

注：與Ctl 組相比，*P ＜0.05

指標體質量（g）實驗前實驗后斑塊面積（10 μm2）纖維帽厚度（μm）脂質沉積（%）膠原成分（%）血管平滑肌細胞（%）巨噬細胞（%）易損指數（%）TC（mmol/L）TG（mmol/L）LDL-C（mmol/L）HDL-C（mmol/L）Ctl 組（n=10）23.32±1.45 27.46±1.59 131.12±2.91 3.07±0.12 15.37±1.59 65.47±0.69 6.07±0.27 1.48±0.23 0.24±0.02 16.91±0.25 1.14±0.47 18.94±2.64 5.54±0.53 Exh 組（n=10）22.72±1.31 27.46±1.59*178.94±3.74*1.31±0.04*17.29±1.25*57.56±1.12*4.44±0.33*2.68±0.51*0.32±0.02*16.97±0.22*1.15±0.44*18.91±2.56*5.47±0.48*Res+Exh 組（n=10）22.75±1.03 25.74±0.75*94.84±3.74*5.65±0.25*13.01±0.97*69.57±0.64*6.63±0.24*1.90±0.23*0.20±0.01*15.69±0.63*0.89±0.40*16.43±3.08*5.99±0.56*

2.3 頸總動脈斑塊局部巨噬細胞、平滑肌細胞的表達Exh 組巨噬細胞表達率（2.68 ± 0.51）%高于Ctl 組（1.48±0.23）%和Res+Exh 組（1.90±0.23）%，相反，SMC Exh 組（4.44 ± 0.33）%最少，Ctl 組（6.07± 0.27）%比Res+Exh 組（6.63 ± 0.24）%少（P＜0.05）。見表1。

2.4 各組易損指數的比較Exh 組（0.32±0.02）%易損指數明顯高于Ctl 組（0.24 ± 0.02）%和Res+Exh 組（0.20±0.01）%，Res+Exh 組高于Ctl 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

2.5 3 組血清血脂指標的比較3 組血清TG、TC、LDL-C 、HDL-C 水平比較差異有統計學意義。Ctl組血脂水平高于Exh 組和Res+Exh 組（P＜0.05），Res+Exh 組最低（P＜0.05）。見表1。

3 討論

動脈粥樣硬化是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的病理基礎，易損斑塊破裂則是引起急性冠脈事件的元兇。力竭狀態是指動物或人進行運動時，直到完全不能運動為止的現象，是疲勞長期積累而引起機體功能紊亂的病理狀態，在進行緊張激烈的運動時，血液中的兒茶酚胺水平升高，心肌需氧量增加，心臟負荷加重，同時機體水分蒸發快，血液黏稠度增高、血管內皮損傷，易出現血小板聚集和血栓形成，引起心肌嚴重缺血，導致猝死［6，13］。BECK 等［14］研究證實，高強度運動也會引起一系列炎癥反應，大量炎癥細胞浸潤，從而導致機體各種疾病和損傷的發生。在消耗性體力活動期間，急性心肌梗死的風險暫時增加，在12 461例急性心肌梗死的患者中，在梗塞發作時有13.6%的病例處于體力活動，這點也提示力竭運動狀態可能成為急性心肌梗死的誘因［13，15］。本研究發現Exh 組與Ctl 組和Res+Exh 組相比，斑塊面積大于Ctl 組和Res+Exh 組，纖維帽厚度最薄，易損指數遠遠大于Ctl 組（P＜0.05），說明力竭運動可能誘導易損斑塊破裂，增加斑塊的不穩定性。

圖1 3 組石蠟切片HE 染色病理結果Fig.1 Pathological results of HE staining of paraffin sections in three groups

圖2 力竭運動和抗阻運動對易損指數的影響Fig.2 Effects of exhaustive and resistive exercises on the vulnerability index

已有研究報道抗阻運動使CHD 患者獲益，增加骨骼肌質量和力量，提高基礎代謝率，加強運動耐力［7-8］，改善胰島素抵抗［11］。研究發現3 個月的有氧結合抵抗運動明顯降低補體C1q/腫瘤壞子因子相關蛋白水平，抗阻運動在改善機體炎癥水平方面優于有氧運動，可以通過降低機體血清炎癥因子水平改善肥胖機體的慢性炎癥狀態。李良等［9-10］研究表明8 周有氧運動或抗阻運動訓練通過提高大鼠肝臟FGF21 的蛋白表達水平促進了脂質代謝并在一定程度上減輕了肥胖大鼠的體質量，改善了血脂水平。研究［16-17］表明急性冠脈綜合征患者心臟康復有氧運動后體質量減輕，肥胖BMI和腹圍的管理與靶器官損害和預后有關。

本研究結果顯示抗阻運動干預組體質量上升幅度較小，血脂水平低，可能與其調整血脂代謝，增加瘦體質量有關，這與上述研究具有一致性。葉城潔等［18］研究發現，力竭運動可以增加乙酰輔酶A 羧化酶的磷酸化水平，激活與脂質代謝相關的基因，分解脂肪酸，降低血脂。而張娜等［19］發現力竭運動導致小鼠脂質代謝紊亂，血清總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）和高密度脂蛋白（HDL-C）水平顯著升高，而甘油三酯（TG）水平顯著降低。ANTHONY 等［20］研究顯示1年抗阻運動改善老年人血脂譜和降低乳糜微粒濃度。這與陳亞麗［21］抗阻訓練有效改善老年超重及肥胖女性的慢性炎癥狀態及降低血脂結果一致。抗阻運動干預組的斑塊面積最小、纖維帽厚度最大，易損指數最小說明其可能有穩定斑塊的作用，究其原因可能與血脂水平改善有關。本研究結果顯示Exh 組的血脂水平高于Res+Exh 組，這與張娜等研究結果力竭運動導致小鼠脂質代謝紊亂相吻合，同時說明抗阻運動降低血脂水平。

巨噬細胞在促進動脈粥樣硬化的進展過程中發揮重要作用，活化的巨噬細胞吞噬LDL-C 形成泡沫細胞，聚集在斑塊的纖維帽中，使斑塊穩定性變弱，容易破裂［22-24］。巨噬細胞浸潤和平滑肌細胞凋亡是斑塊失穩的標志，本研究結果顯示小鼠進行抗阻運動后，頸動脈斑塊局部巨噬細胞的表達比力竭運動組少，平滑肌細胞的表達多于Exh組。抗阻運動可能通過抑制巨噬細胞浸潤和平滑肌細胞凋亡從而起到穩定斑塊的作用。

綜上所述，力竭運動可誘導動脈粥樣易損斑塊破裂，抗阻運動可能起到穩定斑塊的作用，可能與改善血脂水平、抑制巨噬細胞浸潤和平滑肌凋亡有關，其機制值得進一步深入研究。