LHX6基因抑制肺腺癌的轉移機制

張明謙 鄧虹 李艷 陸爽 王媛 羅文娟 劉興園

昆明醫科大學附屬延安醫院急診醫學科（昆明650051）

肺癌遠處轉移是造成肺癌患者預后不良的主要因素之一［1］，常發生于肺腺癌及小細胞肺癌［2］，一旦發生腫瘤轉移將嚴重影響肺癌患者的臨床預后及生存時間，遺憾的是對已發生腫瘤轉移的患者目前的臨床治療手段均無法有效抑制和治療［3］。究其原因是對肺癌遠處轉移的機制尚未闡明，因此，深入開展對肺癌遠處轉移的機制研究對于降低肺癌病死率，改善臨床預后有重要意義。

人類LHX6（LIM homeobox domain 6）基因是編碼LIM 同源域的一類轉錄因子。課題組前期研究發現LHX6 基因在肺癌中是一個受甲基化調控的基因，初步生物學功能研究發現該基因具有抑制肺癌細胞增殖和遷移的作用，是一個典型的抑癌基因［4］，進一步利用公共數據庫分析發現該基因與肺腺癌轉移關系密切。因此，深入研究該基因抑制肺癌細胞增殖和遷移的分子機制，對于闡明該基因的生物學功能，探索新的肺癌防治思路尤為重要。

本研究采用體外實驗和體內實驗相結合的方法，利用Western Bolt、Top/Fop、閃光實驗及熒光素酶報告實驗等方法對LHX6 基因抑制肺腺癌轉移的具體分子機制進行解析，并利用公共數據庫分析該基因表達水平可能的臨床意義，為進一步深入開展研究LHX6 基因提供數據和資料。

1 材料與方法

1.1 肺癌細胞系、裸鼠及所需抗體實驗所需人類肺癌細胞株SPC-A-1、LTEP-A-2 和正常支氣管黏膜細胞HBE 細胞均購自中國科學院生命研究資源中心（上海）。所有的細胞都是在相應培養基中培養（條件10%胎牛血清，溫度37 ℃5%CO2培養箱）。

實驗所需BALB/C-裸鼠8 只（4 周齡，18～20 g購自中國第三軍醫大學動物實驗中心）安置在無菌環境下自由進食。所有的動物護理和程序符合美國國立衛生研究院的指導方針，動物所開展實驗符合動物倫理學規定。

實驗主要抗體包括anti-LHX6（1：1 000，購自Santa CruzBiotechnology），anti-CTNNB1（1：700，購自Santa CruzBiotechnology），anti-MMP7（1：1 000，購自Abcam），anti-c-Myc（1：1 000，購自Santa Cruz Biotechnology），anti-CCND1（1：1 000，購自Santa Cruz Biotechnology），anti-GAPDH（1：2 000，購自碧云天生物技術）。

1.2 實驗方法

1.2.1 公共數據庫分析LHX6 基因與肺腺癌轉移的相關性及可能的信號通路利用公共數據庫的肺癌表達譜數據（http：//kmplot.com/analysis），系統分析LHX6 基因表達與患者預后之間的關系；利用（http：//www.cbioportal.org）公共數據庫分析LHX6基因表達與肺癌轉移的關系；利用公共數據庫（https：//genomecancer.soe.ucsc.edu/）分 析LHX6 基因表達水平影響腫瘤轉移的關鍵基因表達情況。

1.2.2 裸鼠皮下成瘤實驗BALB/C-裸鼠8 只［4周齡，體質量（18±1.9）g，雌雄比例1∶1］無菌環境下自由進食飼養，隨機分為2 組（n＝4）。2 組小鼠分別在皮下注射空載體LTEP-A-2 細胞（8×106）及LHX6 過表達LTEP-A-2-LHX6 細胞（8 × 106），每周測量一次腫瘤體積（V＝1/2×A×B2，A 為長軸，B 為短軸），28 d 處死實驗小鼠，切除腫瘤并稱重，解剖小鼠觀察腫瘤轉移部位，小鼠肝臟切片及H&E 染色評估解剖觀察轉移情況。

1.2.3 細胞遷移和侵襲實驗（Transwell 實驗）采用24 孔8.0 μm Transwell 培養板，暗室上井注入空載體LTEP-A-2 細胞及LHX6 過表達LTEP-A-2-LHX6 細胞以及空載體SPC-A-1 細胞及LHX6 過表達SPC-A-1-LHX6 細胞（細胞注入量5 × 104/孔）及無血清培養基200 μL，暗室下井加入10%FBS 培養12 h（無基質膠遷移實驗）及24 h（含基質膠侵襲實驗），棉簽除膜后取出上井，甲醇固定后0.1%結晶紫染色，高倍鏡下隨機6 個視野細胞計數，觀察細胞遷移及侵襲能力，實驗重復3 次。

1.2.4 Top/Fop Flash 熒光素酶實驗根據LHX6基因啟動子序列設計引物后克隆該基因啟動子全長，克隆入熒光素酶表達載體（pGL3-Basic vector），將LHX6 基因啟動子熒光素酶載體、LHX6/Vector 和內對照PRL-TK 質粒共轉染肺癌細胞SPC-A-1、LTEP-A-2。36 h 后收細胞后采用Promega 雙熒光素酶報告試劑盒（Dual Luciferase Kit）檢測熒光素酶活性的變化，確定LHX6 能夠抑制Wnt/βcatenin 信號通路的轉錄活性。

1.2.5 Wnt/β-catenin 下游基因蛋白及mRNA 表達水平將過表達和干擾LHX6 表達的細胞收集后，提取總RNA 和蛋白質，采用RT-qPCR 和Western blot 檢測Cyclin D1、MMP7、c-Myc 表達水平變化，引物設計如下（表1）。

1.3 統計學方法本實驗數據均采用SPSS 19.0統計軟件處理。數據以均值±標準差表示，組間比較應用Student′st檢驗或Mann-WhitneyU檢驗，Kaplan-Meier 生存曲線分析及Coxregression 回歸分析用于LHX6 基因表達與肺癌預后及轉移關系分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LHX6 基因與肺腺癌轉移的相關性及可能信號通路分析通過公共數據庫（http：//kmplot.com/analysis）分析LHX6 基因表達與臨床預后關系發現，肺腺癌中LHX6 表達與患者預后明顯正相關（圖1A，n＝720，P＝0.000 58）；而在肺鱗癌，LHX6表達與患者預后不相關（圖1A，n＝524，P＝0.14），通過表達譜數據（http：//www.cbioportal.org）分析發現LHX6 表達與肺癌轉移呈顯著負相關（圖1B，P＝0.015），通過影響腫瘤轉移的關鍵基因表達情況分析發現（https：//genomecancer.soe.ucsc.edu/），LHX6 高表達與基因CD44 及基因MMP7 的低表達密切相關（圖1C），進一步通過公共數據庫（TCGA https：//cancergenome.nih.gov/abouttcga/overview） 分析發現肺腺癌中LHX6 高表達與β-catenin 低表達相關，而在肺鱗癌中LHX6 表達與β-catenin 表達無關（圖1D）。

表1 實時定量基因擴增熒光檢測系統（qPCR）引物設計Tab.1 Design of primers for Real-time Quantitative PCR

圖1 LHX6 基因表達水平和不同類型肺癌患者預后、轉移及轉移關鍵基因表達水平相關性分析（公共數據庫分析）Fig.1 Analysis of the correlation between the expression level of LHX6 gene and the clinical outcome，metastasis and transfer key gene expression levels of patients with different types of lung cancer from public databases

2.2 裸鼠皮下成瘤實驗為確定LHX6 基因高表達后具有明顯的抑制腫瘤轉移的作用，本研究通過裸鼠皮下成瘤實驗進行驗證，結果表明LHX6 基因過表達后裸鼠腫瘤體積明顯減?。ū?、圖2A），同時通過對裸鼠肝臟切片觀察發現，LHX6 基因過表達后成瘤裸鼠肝臟轉移明顯減少（圖2B）。實驗數據表明LHX6 過表達后可以明顯抑制肺腺癌轉移發生。

2.3 細胞遷移和侵襲實驗（Transwell 實驗）進一步通過細胞遷移和侵襲實驗（Transwell 實驗）確定LHX6 基因過表達后可以明顯抑制肺腺癌細胞遷移及侵襲能力，實驗結果顯示LHX6 基因過表達后肺腺癌細胞株SPC-A-1、LTEP-A-2 遷移及侵襲能力均明顯得到抑制（圖3）。

2.4 Top/Fop Flash 熒光素酶實驗及Wnt/βcatenin 下游基因蛋白及mRNA 表達水平檢測由于LHX6 基因是一轉錄因子，筆者推測其抑制肺腺癌轉移可能是通過與β-catenin 直接結合來調節其轉錄而實現，為驗證這個假設，本研究進行了熒光素酶報告實驗，數據顯示LHX6 基因過表達后顯著減弱了β-catenin 蛋白活性（圖4A），接下來對Wnt/β-catenin 下游基因蛋白及mRNA 表達水平進行了檢測，結果發現其下游基因Cyclin D1、MMP7、c-Myc 均出現了表達下降情況（圖4B 及圖4C），進一步為了驗證過表達LHX6 可以抑制Wnt/β-catenin信號通路，本研究對β-catenin 蛋白及mRNA 水平進行了檢測，結果發現過表達LHX6 后β-catenin 蛋白及mRNA 水平均顯著下調（圖5A 及圖5B）。實驗數據表明LHX6 基因抑制肺腺癌轉移是通過抑制及Wnt/β-catenin 信號通路來實現。

表2 裸鼠皮下成瘤實驗腫瘤生長情況Tab.2 Tumor growth in subcutaneous tumor formation in nude mice ±s，mm3

表2 裸鼠皮下成瘤實驗腫瘤生長情況Tab.2 Tumor growth in subcutaneous tumor formation in nude mice ±s，mm3

注：與第1 周相比，*P ＜0.05

組別LTEP-A-2-空載體（n=4）LTEP-A-2-LHX6（n=4）周數1 周10.5±2.3 11.2±1.7 2 周503.9±42.1*40.6±5.8*3 周1 239.0±156.7*471.7±99.2*4 周2 031.0±341.8*801.5±145.6*

圖2 裸鼠皮下成瘤實驗結果及肝臟轉移情況病理切片圖Fig.2 Results of subcutaneous tumor formation and liver metastasis in nude mice

圖3 過表達LHX6 基因對肺腺癌細胞遷移及侵襲的影響Fig.3 Effect of overexpression of LHX6 gene on migration and invasion of lung adenocarcinoma cells

3 討論

肺腺癌是肺癌中常見的病理類型［5］，該疾病易發生早期轉移是肺癌難以診治的根本原因之一，造成患者經濟負擔重及病死率高。如何有效地預防和抑制肺腺癌轉移是肺癌有效治療的關鍵因素之一。LHX6（LIM homeobox domain 6）基因是編碼LIM 同源域的一類轉錄因子［6］，前期研究發現LHX6 基因在肺癌中是一個受甲基化調控的基因且具有抑制肺癌細胞增殖和遷移的作用［4］，但其具體的抑制轉移機制尚未清楚，因此深入開展該基因抑制肺癌細胞轉移的機制研究將為有效治療肺癌提供新的思路。

圖4 Top/Fop Flash 熒光素酶實驗結果及Wnt/β-catenin 下游基因蛋白及mRNA 表達情況Fig.4 Top/Fop flash luciferase test and expression levels of Wnt/beta-catenin downstream gene protein and mRNA

圖5 LHX6 過表達抑制β-catenin 蛋白及mRNA 表達Fig.5 LHX6 inhibits the expression of β-catenin protein and mRNA

為明確LHX6 基因在不同肺癌類型中可能有著不同的臨床意義，本研究首先通過公共數據庫對該基因表達與不同的病理類型肺癌的預后進行了分析，結果發現LHX6 基因高表達可以明顯改善肺腺癌患者臨床預后，同時該基因與肺腺癌轉移明顯相關且可以對引起轉移的相關基因表達水平造成影響；為驗證LHX6 基因具有抑制肺腺癌轉移的生物學功能，本研究通過構建裸鼠皮下成瘤實驗及LHX6 表達差異肺腺癌細胞株遷移及侵襲實驗進行證實，數據顯示無論在體內裸鼠皮下成瘤實驗還是體外肺腺癌細胞遷移及侵襲實驗，均明確顯示LHX6 基因過表達后可以明顯抑制肺腺癌細胞轉移；為進一步探索該基因抑制肺腺癌轉移的可能機制，筆者結合前期公共數據庫分析結果和Top/Fop Flash 熒光素酶實驗結果，推測其抑制轉移機制可能為直接抑制Wnt/β-catenin 信號通路實現，為驗證推測，本研究對Wnt/β-catenin 通路下游基因Cyclin D1、MMP7、c-Myc表達水平進行了測定，結果發現LHX6 基因過表達后Cyclin D1、MMP7、c-Myc均出現了不同程度的表達下降，最后本研究對βcatenin 蛋白和mRNA 表達情況進行了測定，結果顯示LHX6 基因過表達后可以明顯降低β-catenin 蛋白和mRNA表達水平，由于β-catenin是細胞粘附連接的重要成分［7］，也是Wnt 信號通路的調節中心［8］，所以筆者有理由認為LHX 基因可以通過直接抑制Wnt/β-catenin 信號通路實現抑制肺腺癌轉移。誠然實驗條件和經費限制，本研究未進一步開展LHX6 基因與Wnt/β-catenin 信號通路結合位點及使用通道抑制劑后該基因表達情況等諸多問題研究，這也將是未來研究的重點之一。

綜上所述，LHX6 基因可以明顯抑制肺腺癌轉移，其抑制肺腺癌轉移是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路影響其下游基因轉錄而實現。