非小細胞肺癌患者外周血中lncRNA SNHG5 的表達及診斷意義

陳剛 史少明 邢雅軍 李雙根 魏晨晨

南京鼓樓醫院高淳分院（南京市高淳人民醫院）1呼吸內科，2腫瘤內科（南京211300）；3南京醫科大學第一附屬醫院腫瘤科（南京210000）

根據美國癌癥協會數據，非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）占所有男性癌癥死亡人數的26%，和女性癌癥死亡人數的25%［1］。盡管NSCLC 在手術、放射治療和抗癌藥物方面進展迅速，但NSCLC 患者的5年生存率仍然很低，僅為16.6%［2-3］。因此，迫切需要利用潛在的機制來鑒定腫瘤發展過程中異常表達的基因，并借此建立具有高敏感性和特異性的新型生物標志物，以促進NSCLC 的早期診斷和治療。

根據ENCODE 聯盟的研究，人類70%的基因組被轉錄為非編碼RNA 分子。非編碼RNA 之前一直被當做轉錄“垃圾”，但現有的研究逐漸發現lncRNA 的細胞功能包括調節細胞增殖和分化或癌癥進展和入侵，它們參與多種癌癥的發生發展［4］。近年來的研究發現多種lncRNA 在NSCLC患者中存在異常表達，可通過表觀遺傳、轉錄及轉錄后翻譯等多種途徑參與NSCLC 的發生、發展及侵襲轉移等過程［5］。此外，研究人員發現lncRNAs可以在血清中穩定的表達，并能夠對NSCLC 進行早期診斷［6］。由于傳統腫瘤生物標志物對早期NSCLC 的敏感性和特異性有限，如癌胚抗原（CEA）、鱗狀細胞癌（SCC）、神經元特異性烯醇化酶（NSE）和細胞角蛋白199（CA199），篩選其他替代分子作為NSCLC 的診斷、預后和預測生物標志物變得至關重要。

研究發現，lncRNA PVT1［7］、DANCR［8］、ZEB1-AS1［9］、SNHG5［10］和HOTTIP［11］在NSCLC 組織中異常表達，并與肺癌細胞的增殖、凋亡和化療藥物耐藥有關。但是，截止目前，并未有研究檢測上述這些lncRNA 在NSCLC 患者血清中的表達水平。因此，本研究通過檢測NSCLC 患者血清lncRNA 表達，與健康者和肺良性結節患者血清lncRNA 表達水平進行比較，篩選出異常表達的lncRNA。有研究結果顯示只有血清SNHG5 表達水平在NSCLC中下調。因此，本研究進一步探討血清SNHG5 與NSCLC 患者病情的相關性，及其在NSCLC 患者中的臨床診斷價值，為NSCLC 的早期診斷提供新型潛在性的生物學標志物。

1 材料與方法

1.1 材料血清和組織RNA 提取試劑TRIzol 購自美國Invitrogen 公司；cDNA 反轉錄試劑盒（PrimeScriptTMRT Master Mix）、RT-qPCR 試劑盒（SYBR Premix Ex Taq Ⅱ）購自日本TaKaRa 公司；lncRNA 和內參基因由上海生工公司合成。

1.2 方法

1.2.1 研究對象收集2017年9月至2018年9月在我院就診的NSCLC 患者60例，男45例，女15例，年齡38～79 歲，平均（52.45 ± 4.39）歲。納入標準：（1）經病理組織學確診為NSCLC；（2）入組前未接受肺癌相關的手術、化放療或生物學治療；（3）根據國際抗癌聯盟的TNM 分期標準［12］，研究對象包括Ⅰ期15例，Ⅱ期26例，Ⅲ期19例。排除標準：（1）合并有其他惡性腫瘤；（2）患者臨床資料不完整；（3）既往接受過其他抗癌治療；（4）入組前半年內接受過手術治療。此外，納入同期在本院健康體檢人群60例為健康對照組，男44例，女16例，年齡35～75 歲，平均（52.45 ± 4.39）歲。并納入同期經手術治療確診為肺良性結節（最大直徑≤3.0 cm）的38例患者，男22例，女16例，年齡37～70 歲，平均（53.61±6.53）歲。收集并記錄NSCLC 患者吸煙史、腫瘤大小和TNM 分期等數據。所有研究對象均簽訂知情同意書。經我院倫理委員會審批同意。

1.2.2 樣本采集抽取所有研究對象空腹靜脈血3 mL 于促凝管中，室溫垂直靜置半小時后，常溫下1 500 r/min 離心10 min，吸取上層液體至標記好的EP 管中，-80 ℃保存備用。同時，留取NSCLC 患者術后1 d、1 周及1、2、4 和6 個月的血標本，按照上述方法準備血清樣本。

1.2.3 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測組織或血清lncRNA 表達用TRIzol 提取各組織或血清的總RNA，通過NanoDrop ND1000 分光光度計（Thermofisher 公司）確定RNA 純度和濃度。隨后，對總RNA 進行反轉錄反應得到cDNA。采用RTqPCR 檢測血清SNHG5 和內參基因GAPDH 的表達，反應體系為：Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，DEPC 水6 μL。PCR 擴增條件為：第一階段：95 ℃5 min），第二階段：95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，35 個循環，每組樣品重復3 次。基因的相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。GAPDH 正向引物：5′- CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3′。反向引物：5′- AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′；PVT1 正向引物：5′- CTAATTATTCGGTAACTGACTTGA-3′。反向引物：5′- ACAGTTCAGCCAATCACTTGGA-3′；DANCR 正向引物：5′-CTGCATTCCTGAACCGTTATCT-3′。反向引物：5′-GGGTGTAATCCACGTTTCTCAT-3′；ZEB1-AS1 正向引物：5′-TTGGCACATACAGCCATC-3′。反向引物：5′-TACCCTGCACAAACCCGAAA-3′；SNHG5 正向引物：5′-TACTGGCTGCGCACTTCG-3′。反向引物：5′-CAGTAAAAGGGGAACACCA-3′；HOTTIP 正向引物：5′-CACACTCACATTCGCACACT-3′。反向引物：5′-TCCAGAACTAAGCCAGCCATA-3′。

1.3 統計學方法采用SPSS 23.0 統計軟件進行統計分析，計量數據以（）表示。兩組間比較分析使用獨立樣本t檢驗；多組間均數比較采用單因素方差分析；計數資料比較用χ2檢驗；受試者工作曲線（ROC）用于評估SNHG5 對NSCLC 的診斷價值，并計算ROC 曲線下面積（AUC）及95%置信區間（95%CI），并計算相應的敏感性和特異性。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SNHG5在NSCLC組織和血清的表達水平本研究檢測既往報道在NSCLC 組織中異常表達的5種lncRNA 在NSCLC 患者和健康體檢者血清中的表達情況。結果表明：健康體檢者、肺良性結節和NSCLC 血清中SNHG5 的表達水平分別為（2.03 ±0.63）、（1.94 ± 0.53）和（1.61 ± 0.57），比較差異有統計學意義（F= 8.48，P＜0.01）；兩兩多重比較結果顯示，NSCLC 血清中SNHG5 表達低于健康體檢者（t= 5.69，P＜0.01）和良性結節患者（t= 3.46，P= 0.01）；而3 組對象血清PVT1、DANCR、ZEB1-AS1 和HOTTIP 表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 NSCLC、肺良性結節患者和健康體檢者血清5 種lncRNA 表達水平Tab.1 Levels of 5 serum lncRNAs in patients with NSCLC，benign pulmonary nodules and healthy subjects ±s

表1 NSCLC、肺良性結節患者和健康體檢者血清5 種lncRNA 表達水平Tab.1 Levels of 5 serum lncRNAs in patients with NSCLC，benign pulmonary nodules and healthy subjects ±s

分組健康對照組良性結節組NSCLC 組F 值P 值例數60 38 60 PVT1 0.79±0.14 0.86±0.17 0.82±0.11 1.74 0.18 DANCR 0.32±0.10 0.30±0.13 0.35±0.09 2.85 0.07 ZEB1-AS1 1.39±0.83 1.27±0.95 1.48±0.75 0.74 0.48 SNHG5 2.03±0.63 1.94±0.53 1.61±0.57*8.48＜0.01 HOTTIP 0.04±0.02 0.03±0.03 0.05±0.02 2.59 0.06

2.2 血清SNHG5 與NSCLC 患者臨床病理特征的相關性進一步分析血清SNHG5 在NSCLC 中的臨床意義， 將NSCLC 患者按照血清SNHG5 的中位數為1.68，分成SNHG5 低表達組和SNHG5 高表達組，每組30例，并分析比較兩組患者的臨床病理特征見表2。SNHG5 低表達與腫瘤大小和有相關性（P= 0.036），但與性別、年齡、吸煙和臨床TNM 分期無相關性（均P＞0.05）。隨后，進一步比較不同分期的NSCLC 患者血清SNHG5 的表達情況（圖1），發現Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期的NSCLC 患者血清SNHG5 表達為（1.20 ± 0.59）、（1.70 ± 0.47）和（1.80 ± 0.54）。與肺良性結節患者比較，Ⅰ期NSCLC 患者血清SNHG5 表達下降，差異有統計學意義（P＜0.001）。根據上述結果，筆者推測SNHG5 的下調可能與NSCLC 的病情有關，尤其是NSCLC 早期。

2.3 NSCLC 患者血清SNHG5 水平與NSCLC 臨床常用指標的相關性為了進一步探討血清SNHG5 水平與臨床NSCLC 傳統指標（包括CEA、NSE、CA125 和CA199 等）的相關性，60例NSCLC 患者根據本院規定的正常參考值被分為2 組（表3）。結果發現，血清SNHG5 水平與NSE、CA125 無關，而與CAE和CA199有關（P＜0.05）。

2.4 手術對NSCLC 患者血清SNHG5 水平的影響鑒于血清SNHG5 水平與臨床NSCLC 嚴重程度的相關性，筆者進一步分析手術對血清SNHG5水平的影響。結果顯示：術后1 d 血清SNHG5 水平較術前輕度下降（P =0.005）；術后1 周血清SNHG5 水平較術前相比，差異無統計學意義（P=0.538）。術后個1～6 個月，血清SNHG5 水平較術前均明顯增加，1、2、6 個月的水平分別為（1.91 ±0.73）、（2.03 ± 0.54）和（2.13 ± 0.64）（與術前比較P＜0.05）。見圖2。

表2 NSCLC 患者血清SNHG5 水平與臨床病理特征的相關性Tab.2 Correlation between serum SNHG5 levels and clinicopathological features in patients with NSCLC例

圖1 肺良性結節患者和不同分期的NSCLC 患者血清SNHG5 的水平比較Fig.1 Comparison of serum SNHG5 levels in patients with benign pulmonary nodules and NSCLC patients with different stages

表3 NSCLC 患者血清SNHG5 水平與血清指標的比較Tab.3 Comparison of serum SNHG5 levels and serum indicators in patients with NSCLC ±s

表3 NSCLC 患者血清SNHG5 水平與血清指標的比較Tab.3 Comparison of serum SNHG5 levels and serum indicators in patients with NSCLC ±s

變量CEA（μg/L）≤5.0＞5.0 NSE（ng/mL）≤18.3＞18.3 CA125（U/mL）≤35＞35 CA199（U/mL）≤37＞37例數42 18 49 11 47 13 46 14血清SNHG5 水平1.84±0.52 1.31±0.37 1.79±0.67 1.42±0.53 1.55±0.55 1.49±0.36 1.96±0.48 1.22±0.32 t 值3.712 1.711 0.370 5.398 P 值0.002 0.093 0.712＜0.001

圖2 NSCLC 患者術前和術后血清SNHG5 的水平（n=60）Fig.2 Serum SNHG5 levels in preoperative and postoperative NSCLC patients

2.5 SNHG5 對NSCLC 的診斷價值基于上述結果，ROC 曲線方法被用于分析血清SNHG5 對NSCLC 的診斷價值分析，見表4、圖3。在本研究中，CEA 用 于 診 斷NSCLC 的AUC 值 為0.667（0.575～0.750），敏感性和特異性為61.67%和78.33%；CA199 用于診斷NSCLC 的AUC 值與CEA類似，為0.667（0.575～0.750）；而SNHG5 用于診斷NSCLC 的AUC 值為0.735（0.647～0.812），敏感性和特異性為68.33%和76.67%，較CEA 和CA199 提高。同時，CEA 或CA199 聯合SNHG5 均可以提高診斷NSCLC 的價值。并且，三者聯合診斷NSCLC的價值可提高至0. 796（0.713～0.864），敏感性和特異性為65.00%和83.33%。

表4 ROC 分析不同血清指標對NSCLC 的診斷價值Tab.4 ROC analysis of the diagnostic value of different serum indicators for NSCLC

圖3 SNHG5 聯合CEA 和CA199 在預測NSCLC 中的ROC曲線分析比較Fig.3 Comparison of ROC Curves in SNHG5 Combined with CEA and CA199 when Predicting NSCLC

3 討論

眾所周知，早期診斷是提高肺癌患者生存率的主要途徑，但目前仍難以實現。包括CEA、NSE和CA125 等在內的單一血清學指標對肺癌的診斷敏感性和特異性通常不能令人滿意，特別是對于早期臨床分期［13］。

lncRNA 是一組長度超過200 nt 而沒有蛋白質編碼能力的RNA 分子，最近成為全球研究的焦點［14］。越來越多的研究表明，lncRNAs 在癌癥如乳腺癌、宮頸癌和肺癌中發揮著重要作用［15］。由于可能檢測到癌癥患者的血漿或甚至尿液中的lncRNA，它們可以用作早期診斷癌癥的生物標志物。例如，LI 等［16］發現126例NSCLC 患者血清lncRNA AFAP1-AS1 表達小副增加，其與肺癌病灶大小、病例分期和轉移相關；同時AFAP1-AS1 診斷NSCLC 的AUC 值為0.759（0.692～0.826）。而譚楠等［17］的研究結果表明，NSCLC 患者血清中H19 的表達水平與患者淋巴結轉移及TMN 分期有關。這些發現均表明lncRNA 可以作為肺癌診斷和預后的分子生物標志物。

本研究通過查詢有關文獻，發現PVT1、DANCR、ZEB1-AS1、SNHG5 和HOTTIP 等5 種lncRNA均被報道證實在NSCLC 組織或細胞中異常表達且參與NSCLC 的生物學活性。但是截止目前，并未有研究檢測這5 種lncRNA 在NSCLC 患者血清的表達情況。通過RT-qPCR 實驗，筆者發現上述lncRNA 中只有血清SNHG5 的水平在NSCLC 患者和對照組（包括良性肺結節和健康體檢者）中有差異。SNHG5 是5'TOP 家族的一員，其可促進肝癌細胞的增殖和侵襲［18］。在NSCLC 中，SNHG5 表達下降，且過表達SNHG5 可增加NSCLC 細胞對易瑞沙的敏感性［10］。本研究首次檢測NSCLC 患者血清SNHG5 的表達，發現與NSCLC 組織表達類似，血清SNHG5 表達也顯著下降。目前對于血清SNHG5 的研究較少。只有ICHIGOZAKI 等［19］發現在惡性黑色素瘤患者的血清中表達下降，但其并未進一步探討其臨床意義。本研究首次探討血清SNHG5 在NSCLC 患者中異常表達。血清中SNHG5 的表達水平與患者年齡、性別及吸煙無相關性，但與病灶大小有關，提示其可能參與NSCLC 的增殖但仍需要動物在體和離體細胞實驗證明SNHG5 參與NSCLC 的增殖。此外，雖然Ⅱ期和Ⅲ期患者血清SNHG5 水平與健康體檢者差異無統計學意義，Ⅰ期NSCLC 患者血清SNHG5 水平顯著低于肺良性結節患者，提示SNHG5 具有早期診斷NSCLC 的價值。但是，本研究納入的病例缺乏Ⅳ期患者，故仍需要擴大樣本，進一步分析血清SNHG5 在NSCLC 中的臨床意義。同時，本研究還發現，術后患者血清SNHG5 水平與術前比較，具有顯著增加的趨勢，提示SNHG5 在評估NSCLC 術后病情方面也有潛在價值。但需要納入術后復發患者來驗證這一假設。

此外，本研究進一步比較了SNHG5 與傳統診斷NSCLC 的血清學指標，發現SNHG5 與CEA 和CA199 相關，進一步比較了以上3 者診斷NSCLC 的價值。結果發現，SNHG5 診斷NSCLC 的價值均高于CEA 或CA199。鑒于目前多指標聯合診斷可顯著提高診斷價值［20］，筆者分別聯合了2 項或3 項指標，發現聯合三項指標診斷NSCLC 的AUC 值達0.796，顯著高于單項或2 項指標的AUC 值，且具有較高的特異性（83.33%），表明聯合檢測血漿SNHG5、CEA 和CA199 早期診斷NSCLC 具有可行性，可考慮在臨床使用。

綜上所述，本研究首次發現SNHG5 在NSCLC患者血清中表達下降，并且SNHG5 表達水平與NSCLC 患者腫瘤大小相關；Ⅰ期NSCLC 患者血清SNHG5 較健康者下降。此外，SNHG5 表達水平與CEA 和CA199 相關；血清SNHG5 可用于早期診斷NSCLC，且在評估NSCLC 術后病情方面也有潛在價值。