體外抗氧化試驗篩選抗氧化肽的方法比較

（1.河北農業大學食品科技學院，河北保定071000；2.河北科技大學生物工程學院，河北石家莊050000）

體外化學試驗是篩選具有清除自由基活性物質的重要手段，目前報道的有4大類24種方法，這些方法在不同的研究中均有應用[1-6]，由于不同實驗室采用的方法不同，篩選得到的具有抗氧化活性物質的可比性和重復性存在一定的差異。特別是在抗氧化肽開發應用中，探索具有重復性較強的體外化學試驗方法將有利于抗氧化肽高通量快速篩選。本研究以公認的體外抗氧化性較強的還原性谷胱甘肽[7-8]為研究對象，對在抗氧化肽開發過程中常用的清除DPPH·[9-10]、ABTS+·、·O2-、·OH，測定超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD），還原Fe3+和Cu2+能力試驗進行對比研究驗證，從而尋找出適合在抗氧化肽初篩中的最適方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

谷胱甘肽、ABTS、DPPH：北京博奧拓達科技有限公司；抗氧化肽 467（Pro-His-Cys-Lys-Arg-Met）、抗氧化肽568（Pro-Phe-Thr-Arg-Asn-Tyr-Tyr-Val-Arg-Ala-Val-Leu-His-Leu）、抗氧化肽 567（Val-Tyr-Gln-Phe-Leu）、抗氧化肽 580（Trp-Asn-Trp-Ala-Asp）：上海強耀生物科技有限公司；維生素C（vitamin C，VC）：北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇、鐵氰化鉀、無水硫酸銅、新銅試劑、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯乙酸、三氯化鐵、醋酸銨、冰乙酸-脂肪酸蔗糖酯均為分析純：天津市凱通化學試劑有限公司；超氧陰離子自由基（superoxide radical，·O2-）測試盒、羥自由基（hydroxyl free radical，·OH）測試盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

UV-1700PC紫外可見分光光度計：上海美析儀器有限公司；HW·SY11型電熱恒溫水浴鍋：北京市長風儀器儀表公司。

1.3 主要試劑配置

1.3.1 抗氧化肽母液配制

水溶性肽：蒸餾水直接溶解，配制成1 g/mL的溶液；水溶性較差的肽：加入乳化劑脂肪酸蔗糖酯配置成1g/mL的乳濁液。根據試驗的實際需要，用蒸餾水稀釋成一系列不同濃度的使用液。

1.3.2 VC對照品配制

將VC配制成0.1 mg/mL的VC母液。根據試驗的實際需要，用蒸餾水將VC母液稀釋至不同倍數，得到一系列不同濃度的使用液。

1.4 方法

1.4.1 清除DPPH·試驗

DPPH·測定過程中試劑的加量見表1。按照表1加入配好的試劑，搖勻后室溫避光反應30 min，517 nm測定其吸光度。按照公式（1）進行清除率計算。

表1 DPPH·測定過程中試劑的加量Table 1 The amount of reagent in the DPPH·determination

式中：Ac表示3 mL DPPH·與1 mL待測樣避光反應30 min，517 nm測定的吸光度；Ad表示1 mL待測樣與3 mL乙醇避光反應30 min，517 nm測定的吸光度；Ak表示3 mL DPPH·與1 mL樣品溶劑避光反應30 min，517 nm測定的吸光度。

1.4.2 清除ABTS+·試驗

由于ABTS+·在734 nm處進行測定，多肽在該波長下對測定沒有干擾。按照表2進行測定，根據公式（2）計算清除率。

表2 ABTS+·測定過程中試劑的加量Table 1 The amount of reagent in the ABTS+·determination

式中：Ac表示3.6 mL ABTS+·與0.4 mL待測樣避光反應5 min，734 nm測定的吸光度；M表示3.6 mL ABTS+·與0.4 mL樣品溶劑避光反應5 min，734 nm測定的吸光度。

1.4.3 清除羥自由基（·OH）試驗

按照試劑盒使用說明進行試驗，適當調整樣品濃度。

1.4.4 清除超氧陰離子自由基（·O2-）試驗

按照試劑盒使用說明進行試驗，適當調整樣品濃度。

1.4.5 鐵離子還原能力試驗

試驗步驟和試劑配制參考文獻[11]。

1.4.6 銅離子還原能力試驗

試驗步驟和試劑配制參考文獻[12]。

1.4.7 測定超氧化物歧化酶（SOD）能力試驗

按照試劑盒使用說明進行試驗，適當調整樣品濃度。

1.5 數據處理

數據處理采用orign8.0和SPSS15.0；其中DPPH·、ABTS+·、·O2-、·OH 和 SOD 采用被測量的拮抗劑的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）評價清除效果，根據清除率與濃度的對數呈線性的關系利用orign8.0回歸得到直線方程，而后計算得到；Fe3+和Cu2+還原能力采用吸光度在0.72（記做IC0.72）處的濃度評價比較，將吸光度與濃度做線性方程后求得0.72處吸光度的濃度。為了避免操作過程中造成的誤差，以VC作為參考。最后對自由基清除評價采用相對清除率（relative clearance rate，RIC），即抗氧化肽的清除率與VC的清除率的比值見公式（3）。

2 結果與分析

2.1 同一試驗人員7種方法測定谷胱甘肽抗氧化能力結果比較

采用1.4的試驗方法測定谷胱甘肽抗氧化能力，結果見表3。

表3 谷胱甘肽抗氧化能力比較Table 3 The comparison of antioxidant capacity of glutathione

從表3中可知，采用不同方法評價谷胱甘肽的抗氧化能力結果存在較大的差異，這樣對于新型抗氧化肽的開發存在無法比較的問題。從各種方法的標準偏差（standard deviation，S-RIC）和變異系數（coefficient of variation，CV）發現，采用化學性質較穩定的DPPH·和測定SOD活性的試驗對谷胱甘肽的抗氧化性評價較為合理。

DPPH·作為一種穩定的化學自由基在測定過程中受外界因素影響小，精密度較高可以作為抗氧化肽篩查方法考慮；SOD具有較強的活性，在體內正常代謝過程中存在，黃嘌呤氧化法已經較為成熟，在較多的書籍中均有該方法的詳細描述，試驗結果發現無論是精密度還是變異系數均可以接受，也可以作為抗氧化肽篩選方法的一種。而·OH作為最活潑的羥自由基，其變異系數達到了34.81%，這樣對于新型抗氧化肽的篩選非常不利。ABTS+·法雖然精密度高，但每進行一次測定均需重新校準測定液吸光度，這也是導致其變異系數較大的原因。采用·O2-篩選抗氧化肽的精密度和變異系數均不理想，采用金屬離子鐵和銅進行篩選，雖然精密度較好，但是變異系數較大，因此也不太適合新型抗氧化肽的篩選。

2.2 利用DPPH·和SOD法評價合成抗氧化肽568、580、467和 567

利用確定的DPPH·和SOD的方法測定4種合成的抗氧化肽的活性結果見表4。從表4中利用這兩種方法測定4種肽的變異系數較低，說明這兩種方法可以有效的作為篩選抗氧化肽的方法。

2.3 不同試驗人員對7種方法測定谷胱甘肽抗氧化能力的作用結果

為了驗證試驗的穩定性另外3名試驗人員按照試驗步驟和方法進行試驗，結果如表5所示。

表4 4種合成抗氧化肽對DPPH·和SOD的作用結果Table 4 The removal of DPPH·and SOD by four synthetic antioxidant peptides

表5 谷胱甘肽抗氧化能力比較的驗證試驗結果Table 5 The verification test results of glutathione antioxidant capacity comparison

從表5中可知對于同一試驗人員和不同試驗人員來講，DPPH·和SOD的變異系數都比較低，因此采用這兩種方法進行抗氧化肽的篩選具有可行性。

2.4 不同試驗人員對4種抗氧化肽作用DPPH·和SOD的試驗結果

另外3名試驗人員對合成的4種肽進行了驗證試驗，結果如表6所示。

從表6中可知無論是試驗人員自己的變異系數還是不同試驗人員之間的變異系數均在可接受范圍內，從而證實采用DPPH·和SOD進行抗氧化肽的篩選具有可行性。

表6 驗證4種合成抗氧化肽對DPPH·和SOD的作用結果Table 6 The verification of the effects of four synthetic antioxidant peptides on DPPH·and SOD

3 結論

在篩選抗氧化肽方法的試驗中，·OH作為最活潑的羥自由基，其變異系數高達34.81%；ABTS+·法、采用金屬離子鐵和銅進行篩選，雖然精密度高，但變異系數較大；采用·O2-篩選抗氧化肽的精密度和變異系數均不理想。因此以上5種方法均不太適合抗氧化肽的篩選。

清除DPPH·和SOD無論是精密度還是變異系數均在可接受范圍，具有良好的穩定性、易操作性及重現性，因此清除DPPH·和SOD可以作為抗氧化肽初步篩選的方法。