QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法測定茶葉中氟唑磺隆和氟吡磺隆含量

（泉州出入境檢驗檢疫局綜合技術服務中心，福建泉州362000）

氟唑磺隆（flucarbazone-sodium）是磺酰脲類內吸型除草劑，原藥外觀為無嗅、無色的結晶粉末。對野燕麥、雀麥、看麥娘等禾本科雜草和多種雙子葉雜草的防治有明顯成效，其有效成分可被雜草的根和莖葉吸收，通過抑制雜草體內乙酰乳酸合成酶的活性，破壞雜草正常的生理生化代謝而發揮除草活性。氟唑磺隆可有效防除小麥田大部分禾本科雜草，同時也可防除控制部分闊葉雜草[1-3]。氟吡磺隆（flucetosulfuron）是韓國LG生命科學公司研制生產的磺酰脲類除草劑，2007年獲得農業部農藥臨時登記，屬低毒品種，作用機理是抑制雜草乙酰乳酸合成酶的活性，主要用于水稻苗后處理防除多種一年生雜草[4]。

氟唑磺隆與氟吡磺隆均屬于磺酰脲類除草劑，其典型特征是活性高，安全性好，使用方便，殺草廣譜，可以控制多種一年生和多年生雜草，適用于全世界的各種稻作方式，對稻田雜草的控制做了很大的貢獻。GB 2763-2016《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》中規定農藥氟唑磺隆（flucarbazone-sodium）在小麥中的最大殘留限量為0.01 mg/kg，氟吡磺隆（flucetosulfuron）在糙米中的最大殘留限量為0.05 mg/kg；而在其他類別產品中目前暫無限量要求。氟唑磺隆和氟吡磺隆作為稻田廣泛使用的磺酰脲類除草劑，雖然在我國茶園并未登記使用，但事實上是存在稻田和茶園相毗鄰的情況，也就可能發生通過灌溉水等方式發生交叉污染的情況發生，同時也存在除草劑誤用的可能；而實驗室在茶葉的日常農殘篩查過程中監測到相關物質，所以有必要建立茶葉中相關檢測方法進一步對茶葉中氟唑磺隆和氟吡磺隆的監測。

目前氟唑磺隆和氟吡磺隆的檢測方法主要是液相色譜法和液相色譜-串聯質譜法，檢測對象主要是大米、小麥和土壤，當前國內尚無茶葉中氟唑磺隆與氟吡磺隆的檢測標準及方法。Jung等[5]采用液相色譜-串聯質譜聯用法測定大米、稻桿中氟吡磺隆及其代謝物的殘留量；Chan等[6]采用高效液相色譜紫外檢測法測定了糙米和土壤中氟吡磺隆殘留量；Xue等[7]使用石墨化碳黑吸附劑（graphitized carbon black，GCB）進行凈化建立了小麥和土壤中氟唑磺隆殘留量及其降解物殘留量的液相色譜-串聯質譜聯用檢測方法；侯紅敏等[8]采用高效液相色譜法建立了土壤、麥粒和植株中氟唑磺隆殘留的分析方法，秦曙等[9]通過液相色譜-串聯質譜法測定了小麥麥粒、麥秸及土壤中氟唑磺隆的 殘 留 。 QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）-高效液相色譜-串聯質譜技術因其快速、簡單、廉價、高效的特點，已廣泛用于動植物源性食品農產品中農獸藥殘留、真菌毒素等的分析檢測[10-18]。本文建立了基于吸附性能好、凈化效率高的石墨化碳黑粉末作為吸附劑的QuEChERS方法，聯合超高效液相色譜-串聯質譜聯用法檢測了茶葉中氟唑磺隆與氟吡磺隆殘留，方法操作簡單、快速、準確、便宜，能滿足茶葉中氟唑磺隆與氟吡磺隆殘留的檢測需求。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜串聯四極桿質譜聯用儀（AB SCI EX 3500）：美國AB 公司；漩渦混合器（EOFO-945066）：美國Talboys公司；旋渦混勻器（MS 3 basic）：德國IKA公司；離心機（RJ-TDL-60B）：無錫市瑞江分析儀器有限公司；粉碎機（FW-80）：天津市泰斯特儀器有限公司。石墨化碳黑吸附劑[graphitized carbon black（GCB）sorbent]、N-丙基乙二胺吸附劑[primary secondary amine（PSA）sorbent]、C18粉末：安捷倫公司；農藥標準品氟唑磺隆與氟吡磺隆（含量＞99.0%）：上海安譜實驗科技股份有限公司；乙腈、甲醇、乙酸乙酯（色譜純）：美國M-TEDIA公司；乙酸銨、甲酸（HPLC級）：美國ROE scientific INC；試驗用水均為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 QuEChERS凈化管的填裝

向2 mL離心管中加入合適質量的GCB、C18、PSA和無水硫酸鎂混合而成。

1.3 樣品前處理方法

將茶葉樣品用粉碎機粉碎，過20目篩，混勻，標明樣品標記。稱取1 g試樣（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈漩渦振蕩提取10 min，4000 r/min離心，待凈化。取提取液1 mL轉移至填裝好的QuEChERS凈化管中，將離心管蓋好后2 000 r/min旋渦振蕩30 s，靜置后取上清液過0.22 μm有機濾膜后供超高效液相色譜-串聯質譜聯用儀測定。

1.4 色譜與質譜條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITYUPLCBEHC18反相柱（2.1mm×100 mm，粒徑1.7 μm）；流動相為A為添加有0.1%甲酸（體積分數）的5 mmol/L乙酸銨水溶液，B為甲醇。梯度洗脫程序為 0～1.5 min，10%～90%B；1.5 min～3.5 min，90%B；3.5 min～3.6 min，90%～10%B；3.6 min～4.5 min，10%B。流速為 0.30 mL/min；柱溫 30℃；進樣量 5 μL。

1.4.2 質譜條件

電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）；正離子掃描模式，掃描方式為多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）；離子源溫度：550℃；毛細管電壓：5 500 V；氣簾氣：172 375 Pa；碰撞氣：48 265 Pa；霧化氣：379 225 Pa；輔助加熱氣：379 225 Pa。

1.5 標準溶液的配制

氟唑磺隆和氟吡磺隆標準儲備溶液：分別準確稱取適量的氟唑磺隆及氟吡磺隆標準品，用乙腈稀釋配制成1 000 mg/L的單種標準儲備液，用乙腈稀釋氟唑磺隆和氟吡磺隆標準儲備溶液，得最終濃度為2 mg/L混合標準溶液；避光4℃保存。

混合標準工作溶液：用乙腈稀釋2 mg/L混合標準溶液得濃度范圍為0.005 mg/L～0.2 mg/L的系列混合標準工作溶液。

基質匹配標準工作溶液：稱取1 g茶葉試樣，按照1.3節進行樣品前處理和1.4節進行上機分析，當目標化合物的定性定量離子對信噪比均小于3時，該試樣確定為空白基質；空白茶葉樣品按照1.3節前處理，得到茶葉基質空白提取液，根據需要用基質空白提取液將中間混合標準溶液稀釋成合適濃度的基質混合標準工作溶液，基質混合標準工作溶液現配現用。

而在政策操作層面，2006年4月，民政部聯合15部委出臺《關于加強孤兒救助工作的意見》。“意見明確界定了新形勢下兒童福利保障的對象包括兩部分，一是失去父母的未成年人，不僅包括機構內集中養育的孤兒、棄嬰，同時也包括社會上的散居孤兒；二是事實上無人撫養的未成年人、流浪兒童、無人撫養的服刑人員未成年子女等困境兒童也納入保障范圍之中”，首次把福利院之外的兒童福利問題納入政策視野。2010年，中國建立了第一個兒童福利津貼制度。《國務院辦公廳關于加強孤兒保障工作的意見》（國辦發[2010]54號）正式出臺。

2 結果與討論

2.1 試驗過程優化

2.1.1 質譜條件的優化

分別取0.2 mg/L的氟唑磺隆與氟吡磺隆標準溶液，以5 μL/min的流速分別注入到離子源，在ESI+和ESI-離子化模式下分別進行全掃描，以選擇適當的電離方式和準分子離子峰。試驗結果表明，氟唑磺隆與氟吡磺隆均更適合在ESI+離子化模式檢測，確定定量、定性離子對后，再對去簇電壓及碰撞氣能量等參數進行優化，優化后的質譜條件見表1。

表1 氟唑磺隆與氟吡磺隆的質譜參數Table 1 Optimized MS/MS condition of flucarbazone-sodium and flucetosulfuron

2.1.2 液相色譜條件的優化

為改善兩種物質的分離度，采用1.4.1梯度洗脫的方式進行，分別考察了甲醇-水和乙腈-水作為流動相時氟唑磺隆與氟吡磺隆的響應情況；為進一步改善質譜信號響應和分離效果，分別在水相中加入5 mmol/L乙酸銨、0.1%（體積分數）甲酸、5 mmol/L乙酸銨+0.1%（體積分數）甲酸考察響應分離情況，結果表明：氟唑磺隆與氟吡磺隆在甲醇-水（5 mmol/L乙酸銨+0.1%（體積分數）甲酸）作為流動相、流速為0.3 mL/min時能獲得最佳的峰型和最好的響應值。優化色譜條件下氟唑磺隆與氟吡磺隆保留時間依次為2.19 min和2.51 min，該條件下定量離子對MRM色譜圖見圖1。

圖1 氟唑磺隆與氟吡磺隆的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of flucarbazone-sodium and flucetosulfuron

2.1.3 提取條件的優化

該試驗采用漩渦振蕩的提取方法，考察了乙腈、甲醇、乙酸乙酯、乙腈-甲苯（體積比9∶1）和乙腈-甲苯（體積比7∶3）5種提取溶劑對茶葉中氟唑磺隆與氟吡磺隆的提取效率。稱取空白烏龍茶樣品1 g，添加0.5 mL 1.0 mg/L的混合標準溶液，加入上述5種溶劑9.5 mL，振蕩提取10 min，離心過濾后不凈化直接上機分析，使用標準工作溶液制作工作曲線進行校正，比較不同提取溶液的提取效率，結果見表2。

表2 不同溶劑對氟唑磺隆與氟吡磺隆的提取結果Table 2 Extraction results of different solvents for flucarbazonesodium and flucetosulfuron

結果表明使用乙腈和乙腈-甲苯（體積比7∶3）為提取溶劑時能獲得較好的提取效率，但乙腈-甲苯（體積比7∶3）溶液得到的提取液顏色更深，為減輕后續凈化步驟的難度并簡化試驗步驟，最終選擇乙腈為提取溶劑。

提取時間方面，比較了振蕩提取5、10、15 min時對提取效率的影響，結果表明10分鐘后延長提取時間氟唑磺隆與氟吡磺隆的回收率未明顯增加，因此試驗選擇振蕩提取時間為10 min。以上試驗對于其他茶葉（紅茶、白茶、普洱茶等）均可獲得一致的結果。

2.1.4 凈化條件的優化

大部分茶類中含有大量的色素和有機酸等雜質，容易對色譜柱和儀器造成污染，影響色譜柱的壽命。為有效去除茶葉中色素和有機酸等雜質，試驗采用QuEChERS方法對提取液進行凈化，試驗考察了C18、GCB和PSA的凈化效果及其對回收率的影響。稱取1 g空白烏龍茶樣品添加0.5 mL 1.0 mg/L的混合標準溶液，按“1.3”進行提取，提取液分別用 C18/MgSO4、GCB/MgSO4和PSA/MgSO43個組合的吸附劑進行凈化，結果顯示，以50 mg GCB+50 mgMgSO4組合凈化后，提取液顏色最淺，凈化效果最好，C18和PSA對色素的吸附能力較差，凈化后提取液的顏色均較深。使用標準工作溶液制作工作曲線進行校正，得到不同吸附劑對樣品進行處理后的加標回收率，結果見圖2。

圖2 不同吸附劑組合對氟唑磺隆與氟吡磺隆加標回收率的影響Fig.2 Effect of different sorbents on recoveries of flucarbazonesodium and flucetosulfuron

如圖2所示，GCB/MgSO4和C18/MgSO4的回收率相當，優于PSA/MgSO4的回收率，最終根據凈化效果和各組合凈化回收率情況，選擇GCB/MgSO4作為凈化吸附劑。試驗比較了不同用量GCB對茶葉提取液的凈化效果及回收率的影響，試驗結果表明，隨著GCB用量增加，溶液顏色逐漸變淺，氟唑磺隆的回收率略微下降，但氟吡磺隆的回收率下降幅度較大。當GCB用量為50 mg時可以獲得較好的凈化效果，最終選擇GCB用量為50 mg。

2.2 基質效應、線性關系、儀器定量限及方法定量限

基質效應是指質譜分析中基質中的干擾物會影響目標化合物的離子化，從而對目標化合物的離子化產生增強或抑制作用。目前，對于基質效應的評價方法較多，本研究參照文獻方法[19]，即提取后分別定量測定空白基質提取液和純溶劑中相同濃度分析物的響應強度，基質效應/%=空白基質標準響應值／純溶劑標準響應值×100。一般情況下，基質效應在80%～120%之間表明時可以忽略，當消除基質超出該范圍時，需要考慮如何消除基質效應。試驗結果表明，烏龍茶、紅茶、綠茶和白茶的樣品基質對氟唑磺隆與氟吡磺隆均存在基質抑制效應，特別是對氟吡磺隆的基質效應更強，所以需要采用基質匹配標準曲線消除樣品的基質效應，基質效應相關數據見表4。

在最優試驗條件下，對基質匹配混合標準溶液進行超高效液相色譜-串聯質譜聯用儀測定，以氟唑磺隆與氟吡磺隆的質量濃度為橫坐標X，單位以mg/L表示，以對應的峰面積為縱坐標Y，繪制標準曲線，得線性方程及相關系數。在空白樣品提取液中（烏龍茶）添加適量的標準工作溶液后，以S/N=10確定方法中氟唑磺隆與氟吡磺隆的定量下限（LOQ）。結果表明，目標化合物在0.000 5 mg/L～0.05 mg/L范圍內的線性關系良好，定量下限均為0.005 mg/kg，相關數據詳見表3。

2.3 回收率與精密度

選用不含目標化合物的烏龍茶、綠茶、紅茶、普洱茶樣品為基質，按照測定低限選擇加入濃度不同的氟唑磺隆與氟吡磺隆標準混合溶液，按最優化的方法進行前處理后上機，平行測定6次，基質匹配標準曲線外標法定量，得相應的回收率和相對標準偏差，見表4。

表3 方法的回歸方程、相關系數、線性范圍、儀器定量限、方法定量限Table 3 Linear ranges，regression equations，correlation coefficients（r），LOQs of instrument and method

表4 氟唑磺隆與氟吡磺隆在茶葉中的基質效應、加標回收率和相對標準偏差（n=6）Table 4 Matrix effect，recoveries and relative standard deviations（RSDs）of flucarbazone-sodium and flucetosulfuron in tea（n=6）

結果表明，氟唑磺隆和氟吡磺隆在0.005、0.02、0.1 mg/kg加標水平下的平均回收率分別為92.8%～110.3%和85.2%～97.6%，相對標準偏差（n=6）分別為3.42%～9.27%和3.65%～10.35%。

2.4 實際樣品的檢測

應用本方法對100個茶葉產品（包括烏龍茶、綠茶、紅茶、普洱茶）進行了檢測，結果在一個烏龍茶樣品中檢出氟唑磺隆，檢測值為0.016 mg/kg。

3 結論

首次建立茶葉中氟唑磺隆和氟吡磺隆的超高效液相色譜-串聯質譜儀快速檢測含量的方法。研究了不同提取溶劑、吸附劑種類及吸附劑用量對提取凈化效率的影響。試驗結果表明：在優化試驗條件下，氟唑磺隆和氟吡磺隆在0.000 5 mg/L～0.05 mg/L范圍內線性關系良好，相關系數（r）均大于0.998，氟唑磺隆和氟吡磺隆的方法定量限均為0.005 mg/kg。氟唑磺隆和氟吡磺隆在0.005、0.02、0.1 mg/kg加標水平下的平均回收率分別為92.8%～110.3%和85.2%～97.6%，相對標準偏差（n=6）分別為3.42%～9.27%和3.65%～10.35%；該方法操作簡單、快速、靈敏、成本低，能滿足茶葉中氟唑磺隆和氟吡磺隆的檢測需求。