頂空固相微萃取結合GC-MS分析花椒油香氣成分

張玉霖，周亮，陳莉，舒婷

（湖北科技學院藥學院，湖北咸寧437100）

花椒（Zanthoxylum bungeanum）系蕓香科花椒屬植物，分為紅花椒（Zanthoxylum Bungeanum Maxim）和青花椒（Zanthoxylum schinifolium Sieb．etZucc.）兩個類別，在我國的山東、四川以及陜西等地都有大面積種植[1-2]。在我國，花椒作為一種常用調味料使用已經有兩千多年的歷史，它可以給菜品帶來麻香風味，也可以用于去除各種肉類的腥氣，對個人而言則具有促進唾液分泌增加食欲的作用[3]。花椒也可以用作中藥，有溫中散寒、除濕止痛、殺蟲解毒、治療嘔吐、風寒濕痹、齒痛等功效[4]。目前，國內外對于花椒的研究主要集中在對生花椒的提取和分析，對花椒油的研究相對較少[5]。采用新鮮花椒制成的高品質花椒油、鮮花椒油香氣濃郁，但其香氣大多通過嗅聞來測試。鑒于此，本研究采用頂空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）結合氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術，對花椒油的揮發性香味物質進行提取、分析研究，以期為建立花椒油揮發性風味成分圖譜數據庫、評價花椒油的品質提供數據支持[6]。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

花椒油：購買于超市；氯化鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器

7890A-5975C氣質聯用儀：美國Agilent公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取頭、65 μm PDMS/DVB固相微萃取頭、HP-5MS石英毛細柱（30 m×0.25 μm，0.25 μm）：美國 Supelco公司；85-2恒溫數顯磁力攪拌器：金壇市新航儀器廠；EL204電子天平：上海Mettler Toledo公司；KHW-D-4電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫療儀器有限公司。

1.3 揮發性成分的測定

1.3.1 揮發性物質的萃取

在使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭萃取花椒油揮發性香氣成分前，先將萃取頭進行老化。老化的條件為：250℃，載氣流量為2 mL/min，老化時間為90min。無干擾峰的出現則作為老化結束的判斷依據[7]。準確稱量5 mL的花椒油樣品于頂空瓶中，加蓋密封，將其置于50℃的恒溫水浴中進行攪拌吸附，吸附時間為40 min。然后將固相微萃取萃取頭吸附于GC進樣口，在250℃的條件下進行解吸，解吸時間為5 min。試驗平行重復3次，進行數據采集與分析。

1.3.2 揮發性香氣成分半定量分析

結合Nist和Wiley軟件進行質譜檢索，正反匹配度均大于800時予以選擇。半定量分析：采用峰面積歸一法進行相對含量定量。

式中：M為單組份香氣成分的峰面積；N為總峰面積。

1.4 固相微萃取條件的優化

對花椒油揮發性香氣成分的萃取影響較大的是總峰面積以及主峰面積，因此選用總峰面積和主峰面積作為考察指標，選擇烯、醇和酯類等主要揮發性香氣物質的峰面積作為分析萃取效果的判斷依據。按照“1.3.1”方法，采用單因素試驗，考察纖維萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB 固相微萃取頭）、磁力攪拌（有、無）、電解質NaCl（有、無）、萃取時間（20、30、40、50、60 min）以及萃取溫度（30、40、50、60、70、80℃）對花椒油香氣成分的萃取的影響，進行優化選擇。

1.5 氣相色譜和質譜條件

1.5.1 色譜條件

HP-5MS石英毛細柱；載氣：He，0.9 mL/min恒速流動。進樣口溫度250℃。進樣：不分流；程序升溫：初始溫度設置為40℃，保持2 min，以4℃/min速度上升至160℃，再以10℃/min上升至250℃，保持5 min。

1.5.2 質譜條件

EI+，EI離子源溫度200℃，電子能量70 eV，燈絲發射電流200 μA，接口溫度250℃，掃描質量范圍：30 amu～400 amu。

2 結果與分析

2.1 市售花椒油揮發性香氣成分萃取條件的優化

2.1.1 纖維萃取頭的選擇

萃取頭是香氣成分萃取的關鍵，不同型號的萃取頭表面涂層有差別，對揮發性物質的吸附富集能力也不同。本試驗選擇2種商業SPME萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS和65 μm PDMS/DVB 涂層），對其進行優化選擇。其中，65 μm PDMS/DVB主要是用于揮發性物質、胺類、硝基芳香類化合物的分析，50/30 μm DVB/CAR/PDMS主要用于香味物質（揮發性和半揮發性C3～C20）的分析。萃取頭對萃取效果的影響見圖1。

圖1 萃取頭對萃取效果的影響Fig.1 Comparison of different SPME fibers on extraction of volatiles incommercially Zanthoxylum essential oil

由圖1可以看出，在花椒油GC-MS分析結果中，PDMS/DVB萃取頭的總峰面積和主峰面積均小于DVB/CAR/PDMS萃取頭。這主要因為50/30 μm DVB/CAR/PDMS是雙極性的，復合涂層對揮發性物質具有多重的選擇性和吸附性[8]。因此，本試驗選用50/30 μm DVB/CAR/PDMS作為花椒油揮發性香氣成分分析的萃取頭。

2.1.2 攪拌對萃取效果的影響

使用磁力攪拌可使待測揮發性香氣物質加速揮發，因此考察磁力攪拌對市售花椒油揮發性香氣成分萃取效果的影響。磁力攪拌對萃取效果的影響見圖2。

圖2 磁力攪拌對萃取效果的影響Fig.2 Effect of stirring on extraction of volatiles in commercially Zanthoxylum essential oil

由圖2可以看出，經過攪拌后的市售花椒油揮發性香氣成分的總峰面積比未攪拌的花椒油揮發性成分的總峰面積變化要大，但是主峰面積變化相對不大。這說明，在花椒油中，某些低含量或者低揮發性的成分可以通過磁力攪拌促進揮發，進而被萃取頭吸附。為盡可能保證對花椒油特征性香氣成分進行完整的分析，本試驗選擇磁力攪拌的方式。

2.1.3 添加電解質（NaCl）對萃取效果的影響

NaCl作為一種電解質，對于一些香氣物質來說可以促進其揮發度，從而提高萃取頭對目標揮發性物質的萃取效率。因此考察電解質NaCl（0.2 g/mL）的加入對花椒油香氣成分萃取效果的影響，結果如圖3所示。

圖3 無機鹽（NaCl）添加對萃取效果的影響Fig.3 Effect of NaCl on extraction of volatiles in commercially Zanthoxylum essential oil

由圖3可見，NaCl的加入對花椒油揮發性香氣成分萃取效果的影響不顯著，這可能是由于NaCl作為一種無機鹽易溶于水相，而花椒油作為油相限制了NaCl對花椒油揮發性香氣物質的萃取。

2.1.4 萃取溫度對萃取效果的影響

溫度升高一方面可以促進樣品揮發性香氣成分揮發，另一方面也會使得萃取頭吸附的揮發性香氣成分吸附量減少。因此考察不同萃取溫度對花椒油揮發性香氣成分萃取效果的影響，結果如圖4所示。

圖4 萃取溫度對萃取效果的影響Fig.4 Effect of temperature on extraction of volatiles in commercially Zanthoxylum essential oil

由圖4可以看出，隨著萃取溫度的升高，花椒油揮發性香氣成分的氣相色譜圖的總峰面積和主峰面積均呈現先增后降的趨勢。在50℃時達到最大值，因此選用50℃作為市售花椒油揮發性香氣物質的最適萃取溫度。

2.1.5 萃取時間對萃取效果的影響

萃取時間是指揮發性物質在萃取頭吸附薄膜、頂空和樣液中處于三項平衡分配所需的時間，也就是從萃取到萃取完畢所需的時間。考察萃取時間對花椒油揮發性香氣成分萃取效果的影響，結果如圖5所示。

圖5 萃取時間對萃取效果的影響Fig.5 Effect of time on extraction of volatiles in commercially Zanthoxylum essential oil

由圖5可以看出，萃取時間在20 min～40 min之間時，隨著萃取時間的增加，萃取頭不斷對花椒油中揮發性香氣成分進行富集，氣相色譜圖中的總峰面積和主峰面積均呈現上升趨勢，在40 min時主峰面積和總峰面積達到最大值。因此，選取40 min作為花椒油揮發性香氣成分的最佳萃取時間。

2.2 花椒油揮發性成分的GC-MS檢測結果

采用優化后的市售花椒油萃取條件對市售花椒油揮發性香氣成分進行萃取，得到了總離子流色譜圖，如圖6所示。

經過計算機與質譜庫的匹配以及人工分析，確定相應化合物的名稱[9]，將花椒油中的揮發性香氣成分匯總，見表1。

圖6 市售花椒油揮發性香氣成分的GC-MS總離子流圖Fig.6 Total ion current chromatogram of GC-MS of aroma compounds in Zanthoxylum essential oil

表1 市售花椒油揮發性香氣成分GC-MS鑒定結果Table 1 Identification of aroma compounds in Zanthoxylum essential oil by GC-MS

續表1 市售花椒油揮發性香氣成分GC-MS鑒定結果Continue table 1 Identification of aroma compounds in Zanthoxylum essential oil by GC-MS

植物油的風味主要取決于品種、成熟度、氣候條件、種植區域、加工工藝以及貯藏條件等因素，市售花椒油應該具有其固有的香氣成分[10-13]。在花椒油中共檢測出47種揮發性成分，占總峰面積的99.65%。含量在5%以上的單體香氣成分共有4種，其中檜烯（13.05%），（E）-β-羅勒烯（14.65%），桉油精（12.16%），乙酸芳樟酯（17.65%），占總含量的57.51%。含量在1%～5%的單體香氣成分共有14種，其中α-蒎烯（2.01%），α-側柏烯（3.45%），β-蒎烯（1.08%），α-松油烯（1.18%），γ-松油烯（2.05%），異松油烯（1.21%），別羅勒烯（2.65%），反式水化香檜烯（2.77%），β-石竹烯（2.47%），小茴香醇（3.55%），乙酸橙花酯（1.08%），乙酸香葉酯（1.76%），側柏酮（1.17%），胡椒酮（2.47%），占總含量的28.90%。其余單體香氣成分的含量均在1%以下，共29種占總含量的13.59%[14-15]。

烯烴類化合物是市售花椒油香氣組分中種類以及相對含量最多的一類物質，共19種，相對含量為50.85%。主要是以（E）-β-羅勒烯、檜烯、α-蒎烯、β-蒎烯、α-松油烯、β-松油烯、石竹烯、異松油烯為代表的萜類及倍萜類物質。這類物質普遍較易揮發，具有強烈的木青氣息、花香和藥草香氣。在這些烯烴類化合物中（E）-β-羅勒烯、檜烯的相對含量達到了10%以上。（E）-β-羅勒烯屬于單萜化合物，在自然界作為一種引發信息素可以抑制工蜂卵巢，加速工蜂行為成熟。檜烯又稱沙賓烯，也是一種單萜烯，具有消炎的作用。α-蒎烯呈現類似松木、針葉及樹脂似的氣息；α-石竹烯、β-石竹烯則有似丁香油的辛香和木香的氣息，在香料中通常被用作辛香的修飾劑，對香味具有增效的性能；具有明顯檸檬特征的果香和青香的檸檬烯以及具有辛辣的茴香氣味的β-欖香烯也參與了花椒油揮發性烯烴類香氣成分的組成。在市售花椒油中檢測到的酯類化合物5種，均為乙酯類化合物，相對含量為21.35%。其中乙酸方樟酯的相對含量高達17.65%。乙酸芳樟酯又名乙酸沉香酯，有令人愉快的花香和果香，香氣似香檸檬和薰衣草，是制備高級香精不可缺少的香料。乙酸橙花酯則有橙花和玫瑰樣香氣；乙酸香葉酯有清甜的香檸檬果香及甜潤的玫瑰、薰衣草樣香氣；乙酸苯乙酯具有玫瑰、海仙花、蜂蜜樣極甜的香氣和甜的水果味。醇類化合物多呈現出清新的花草香氣。在花椒油揮發性香氣成分中共檢測出9種醇類物質，相對含量為18.94%；其中以桉油精和小茴香醇的含量較高。桉油精有與樟腦相似的氣味，小茴香醇則呈現木香、草香、柑橘或某些花香。醛類化合物一般會產生清香的風味，主要有油脂味、堅果味和青草味，多數醛類對油脂風味起到積極貢獻作用[15-16]。在花椒油中檢測到醛類共8種，相對含量為3.42%；Brunschwig等[17]研究發現植物油中C5～C9的醛類化合物多數呈現出脂肪味、水果味或者青草味等；Nieto等[18]研究表明，油脂中的油酸、亞油酸和花生四烯酸經過氧化會產生己醛，2，4-癸二烯醛也可降解得到己醛。己醛呈現生的油脂味和青草氣及蘋果香味，（E）-2-庚烯醛具青草香氣及刺激臭，戊醛具有特殊香味等。在花椒油中共檢測出酮類6種，相對含量為5.09%。在酮類物質中胡椒酮具有類似樟腦和薄荷的香氣，香芹酮具有留蘭香味。

3 結論

1）采用單因素試驗對纖維萃取頭、磁力攪拌、NaCl、萃取時間以及萃取溫度進行優化得到市售花椒油揮發性香氣成分最佳萃取條件。結果表明：采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，在磁力攪拌條件下，萃取溫度為50℃，萃取時間為40 min時花椒油中的揮發性風味物質能最大程度地揮發、吸附。

2）在市售花椒油中共檢測到47種揮發性香氣成分，占總峰面積的91.26%。這些香氣成分中主要以烯烴類為主，相對含量占50.85%，酯類、醇類次之，分別占有相對含量21.35%和18.94%，其他類揮發性香氣成分的含量較低。檜烯（13.05%），（E）-β-羅勒烯（14.65%），桉油精（12.16%），乙酸芳樟酯（17.65%）是其主要的揮發性香氣成分。