重組酶聚合酶恒溫擴增結合乳膠微球試紙條快速檢測金黃色葡萄球菌

高建欣藏雨軒杜欣軍李碩

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，食品營養與安全國家重點實驗室，天津300457；2.南開大學醫學院，天津市食品科學與健康重點實驗室，天津300071）

金黃色葡萄球菌是一種重要的食源性致病菌，廣泛存在于自然界中，在食品加工過程中被金黃色葡萄球菌污染的食品，經食用后會引起食物中毒，這是由于金黃色葡萄球菌可分泌腸毒素和表皮剝落毒素等多種毒素[1]。在我國由金黃色葡萄球菌所引起的食物中毒占細菌性食物中毒的四分之一[2]，給食品安全帶來巨大隱患。目前檢測金黃色葡萄球菌方法主要有傳統分離鑒定[3]和基于聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）的檢測方法[4]。分離鑒定成本低，但操作繁瑣且耗時；PCR需要經歷變性-退火-延伸等熱循環過程，依賴于昂貴儀器設備和專業實驗員，難以在基層及偏遠地區廣泛應用。因此迫切需要一種快速、簡便、靈敏的方法檢測金黃色葡萄球菌。

近年來，恒溫擴增技術由于可以在某一特定溫度進行核酸擴增而備受青睞，主要包括環介導恒溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、鏈置換恒溫擴增（strand displacement amplification，SDA）、滾環恒溫擴增（rolling circle amplification，RCA）、依賴解旋酶恒溫擴增（helicase-dependent amplification，HDA）和重組酶聚合酶恒溫擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）等[5]。恒溫擴增技術彌補了傳統方法和PCR的缺陷，實現了快速和準確檢測，尤其是在缺乏完備實驗室設施的情況下。RPA作為一種新型恒溫快速擴增核酸的方法，與常見PCR不同，RPA可以在單一恒定溫度下（37℃～42℃）快速擴增DNA，在相對短的時間內就可完成檢測[6]。擴增產物可以通過瓊脂糖凝膠電泳、實時熒光或試紙條等檢測。其中，凝膠電泳操作耗時[7]；實時熒光需借助大型儀器，價格昂貴[8]；而試紙條不僅制備簡單，且不需其他設備輔助，只需5min～10 min即可得到結果[9]。試紙條有許多標記物，如膠體金、膠體碳、量子點、彩色乳膠微球等[10]。彩色聚苯乙烯乳膠微球是強疏水性的苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物，微球的粒徑分布均一、穩定性好，在合成乳膠過程中通過加入不同顏色染料可形成多種顏色微球，且顏色穩定不易脫落，可以在一根試紙條上檢測多種不同物質，每種物質分別代表不同顏色，彌補了其他標記物在多重檢測產生顏色混淆的不足[11]。

金黃色葡萄球菌作為一種重要的食源性致病菌，已成為世界多數國家進出口食品法定檢驗檢疫的致病菌之一[12]，因而建立快速有效的方法對預防金黃色葡萄球菌的感染具有重要意義。檢測金黃色葡萄球菌常規方法是基于微生物方法，但耗時耗力，操作繁瑣，不適合快速檢測；另外常見方法是基于PCR的分子生物學方法，如PCR，real-time qPCR和巢式PCR等，然而此類方法均需要昂貴精密的實驗設備，限制了其在現場檢測的應用[13]。本研究將RPA和乳膠微球試紙條（latex microsphere test strips，LMTS）結合，可以快速檢測金黃色葡萄球菌，同時具有高靈敏度和良好的特異性，為食品安全相關領域的快速檢測提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與材料

金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌O157∶H7、志賀氏菌、產氣腸桿菌和單增李斯特菌：天津科技大學食品安全實驗室；酵母粉和蛋白胨：青島海博生物公司；細菌DNA提取試劑盒：北京天根生物有限公司；RPA kit：英國Twist DX公司；乳膠微球：天津大鵝科技有限公司；LB 培養基（luria-bertani，LB）：北京陸橋技術股份有限公司；1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳酰二亞胺鹽酸鹽（1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）、2-N-嗎啡啉乙磺酸（2-morpholinoethanesulfonic acid，MES）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG 20000）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、磷酸緩沖鹽（phosphate buffer，PB）、磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate buffered solution，PBST）、鏈霉親和素、羊抗鼠二抗：美國Sigma公司；鼠抗地高辛抗體：美國Abcam公司；試驗用水均為超純水。

1.1.2 儀器與設備

Milli-Q超純水系統、Milipore HF 90 s硝酸纖維素膜：美國Millipore公司；HFU 586超低溫冰箱：美國Thermo公司；5415R小型高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；SY-1-2電熱恒溫水浴鍋：天津歐諾儀器儀表有限公司；HVA-85高壓滅菌器：日本Hirayama公司；DYY-7C核酸電泳儀、Gel Doc 2000凝膠成像儀：美國Bio-Rad公司；MS3周轉式振搖器：德國IKA公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成

NCBI數據庫中查詢獲得金黃色葡萄球菌nuc基因序列（GenBank：EF529607.1），應用 primer 5.0設計引物，同時上游引物5'端標記地高辛，下游引物5'端標記生物素，引物由蘇州金唯智公司合成。

上游引物：5'digoxin-GCATCACAAACAGATAACGGCGTAAATAGAAG-3'；

下 游 引 物 ：5'biotin-ACATTAATTTAACCGTATCACCATCAATCGCT-3'。

1.2.2 活化和免疫乳膠微球

取 400 μL 乳膠微球溶于 600 μL MES（0.1 mol/L，pH 7.4），加入 20 μL NHS（5 mg/L），充分混勻振蕩，超聲處理2 min，成功活化微球。向活化好的微球中加入15 μL用PB稀釋的抗地高辛抗體（1 mg/mL），4℃靜置孵育2 h，孵育結束后加入20%BSA和PEG 20000，4℃靜置孵育30 min進行封閉。然后4℃條件下 14 000 r/min離心15 min，棄上清，用100 μL金標工作液重懸沉淀，置于4℃冰箱保存備用。

1.2.3 RPA-LMTS檢測金黃色葡萄球菌

RPA 反應體系為 50 μL，其中，2.4 μL 上下游引物（10 μmol/L），29.5 μL 緩沖液，2 μLDNA 模板和 11.2 μL ddH2O，然后加入freeze-dried酶，充分振蕩混勻，最后加入2.5 μL的280 nmol/L MgAc，將反應管置于40℃水浴鍋反應10 min。反應結束后取10 μL產物與2 μL免疫微球混合，然后加入90 μL PBST緩沖液，混勻后滴加在試紙條的加樣孔，5 min后觀察結果。

1.2.4 RPA-LMTS檢測金黃色葡萄球菌的靈敏度

將金黃色葡萄球菌DNA系列稀釋為5 ng、500 pg、50 pg、5 pg、500 fg、50 fg 和 5 fg，RPA 擴增后取 100 μL產物加到試紙條樣品孔中，再加入3.5 μL包被抗體的微球，充分混勻，滴加到試紙條樣品墊上，5 min后觀察結果。取100 μL金黃色葡萄球菌加入含有10 mL LB培養液中，37℃，200 r/min搖床培養8 h，取出后用0.9%NaCl溶液1∶10梯度稀釋加入平板計數瓊脂中，第2天進行平板計數。再準備金黃色葡萄球菌純菌液依次稀釋為 1.2×107、1.2×106、1.2×105、1.2×104、1.2×103、1.2×102、1.2×101CFU/mL 和 1.2×100CFU/mL，使用水煮法提取基因組DNA，即取1 mL菌液置于99℃條件下裂解10 min，后迅速置于冰上冷卻10 min，最后10 000 r/min離心5 min，取上清即為DNA。用RPA最佳體系進行擴增，擴增后100 μL混合物滴加在試紙條樣品孔中，室溫靜置5 min后觀察結果。

1.2.5 RPA-LMTS檢測金黃色葡萄球菌的特異性

提取金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌O157∶H7、志賀氏菌、產氣腸桿菌和單增李斯特菌DNA進行RPA-LMTS特異性驗證。上述試驗菌株DNA作為試驗模板，首先進行RPA擴增，然后取10 μL擴增產物用PBST稀釋至100 μL，再加入3.5 μL包被抗體的彩色乳膠微球，充分混勻，滴加到試紙條樣品墊上，每個試驗重復3次，5 min后觀察檢測結果。

1.2.6 RPA-LMTS檢測實際樣品

通過GB 4789.10-2016《食品安全國家標食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》鑒定樣品中是否含金黃色葡萄球菌。分別稱取25 g（mL）的雞肉、豬肉和牛奶，向其中分別添加1.2×100CFU/g（mL）的金黃色葡萄球菌純菌液。將被人工污染的金黃色葡萄球菌樣品加入到含有225 mL的7.5%NaCl肉湯培養基。分別在培養0、1、2、3、4小時后采集培養物，應用水煮法提取基因組DNA，作為RPA體系的模板。應用RPA最佳體系進行擴增，擴增結束后將100 μL混合物加到試紙條樣品孔中，5 min后觀察結果。

2 結果與分析

2.1 靈敏度分析

靈敏度檢測結果見圖1。

圖1 RPA-LMTS檢測金黃色葡萄球菌靈敏度Fig.1 Sensitivity of the RPA-LMTS assay in detection of S.aureus

金黃色葡萄球菌不同濃度DNA為模板進行RPA試驗，產物用微球試紙條檢測，如圖1a所示，檢測限為500 fg DNA。為確定RPA-LMTS檢測金黃色葡萄球菌純菌液的檢測限，將金黃色葡萄球菌純菌液從1.2×106CFU/mL 10倍梯度依次稀釋至1.2×100CFU/mL。如圖1b所示，隨著金黃色葡萄球菌的濃度增加，檢測線亮度逐漸增加，當濃度為1.2×101CFU/mL時，檢測線亮度與陰性對照有明顯不同。因此，濃度為1.2×101CFU/mL是檢測金黃色葡萄球菌純菌液的檢測限。

2.2 特異性分析

特異性檢測結果見圖2。

選擇金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌O157∶H7、志賀氏菌、產氣腸桿菌和單增李斯特菌驗證RPALMTS特異性，結果顯示只有金黃色葡萄球菌出現質控線和檢測線，而非金黃色葡萄球菌只有一條質控線。結果說明RPA-LMTS特異性良好，不會與其他菌株發生交叉反應。

圖2 RPA-LMTS對金黃色葡萄球菌特異性Fig.2 Specificity of the RPA-LMTS assay in detection of S.aureus

2.3 實際樣品檢測分析

為驗證RPA-LMTS檢測金黃色葡萄球菌的實用性，選擇牛肉、雞肉和牛奶為待測實際樣品，分別接種1.2×100CFU/mL（g）金黃色葡萄球菌，37℃增菌不同時間后收集提取DNA進行RPA-LMTS檢測，結果見圖3。結果顯示1.2×100CFU/mL（g）金黃色葡萄球菌在牛肉、雞肉和牛奶中增菌3小時后可被檢測出。

圖3 金黃色葡萄球菌增菌不同時間RPA-LMTS檢測結果Fig.3 Detection of S.aureus in simulated food samples by RPALMTS after incubation for different times

3 討論

近年來，像LAMP[14]，依賴HDA[15]和RPA等多種等溫擴增技術已廣泛應用于擴增核酸。LAMP是基于Bst DNA聚合酶進行鏈置換和DNA合成，LAMP可以在60 min內，60℃～65℃條件下進行DNA擴增[16]。然而LAMP需要4～6對的引物，且需要跨越6個不同的靶序列，引物設計較為復雜。HDA是利用DNA解旋酶打開雙鏈DNA，并產生單鏈模板用于引物雜交和擴增。使用解旋酶消除了對復雜加熱設備的需求，使反應能在較低的溫度下進行。但在進行HDA前通常需要優化試驗條件，如緩沖液組成和反應溫度等，增加試驗成本[5]。與以上相比，本研究通過建立了RPA-LMTS快速檢測金黃色葡萄球菌，RPA可在40℃條件下擴增金黃色葡萄球菌，大大降低對試驗設備的要求。

RPA是目前最快的核酸擴增技術之一，20 min內即可完成檢測，RPA主要依賴于三種酶：重組酶、單鏈DNA結合蛋白酶和鏈置換DNA聚合酶。在RPA反應中，重組酶先與引物形成復合物，重組酶-引物復合物再與靶目標結合，然后在DNA聚合酶作用下進行擴增[17]。RPA還具有以下優勢：第一，可以在相對較低的溫度下（37℃～42℃）反應[18]；第二，如果樣品中含有某些雜質也不會影響RPA，可省去DNA純化過程，更加便捷和快速[19]；第三，RPA體系中的酶呈凍干態，運輸時不需冷藏，更加便于運輸。當本研究使RPA與LMTS的結合后檢測更加快速，同時靈敏度提高。RPA-LMTS僅需15 min即可獲得結果（包括10 min擴增和5 min檢測），檢測限為500 fg DNA和1.2×101CFU/mL純菌液，且與非金黃色葡萄球菌無交叉反應，當實際樣品污染量為1.2×100CFU/mL（g）金黃色葡萄球菌時，可在3.5 h內完成檢測。RPA-LMTS可應用于在基層單位和現場檢測金黃色葡萄球菌。