黑曲發酵茯苓多糖免疫調節作用研究

李世杰，李勇，曾海英

（貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025）

茯苓（Poria cocos），又名茯菟、萬靈桂、茯靈等[1]，是寄生于松科植物馬尾松或赤松等樹根上，擔子菌綱非褶菌目多孔菌科的一種，為藥食兩用真菌，主要功能成分為茯苓多糖，約占茯苓干重的84.2%[2]。茯苓多糖，分子結構多為β-（1→3）-D-葡聚糖，含有少量β-（1→6）糖苷鍵側鏈，具有多重生物活性，如：抗腫瘤、免疫調節、保肝作用等[3-4]。在免疫調節方面，茯苓多糖對特異性和非特異性免疫功能均有促進作用[5]。候瑋婷等[6]研究發現灌胃復方茯苓多糖口服液，對小鼠實體瘤有顯著抑制作用且能促進小鼠淋巴細胞增殖和自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）活性。張秀軍等[7]通過體內外給藥觀察小鼠脾淋巴細胞的增殖作用和巨噬細胞吞唾中性紅的能力，結果表明羧甲基茯苓多糖（carboxymethylpachymaran，CMP）可增強巨噬細胞和淋巴細胞的功能，體內外均能顯著增強小鼠免疫功能。但茯苓多糖具有的分子量高、結構緊密、水溶性差等特性，生物活性利用率不高[8]。林標聲等[9]研究了高取代度羧甲基茯苓多糖的制備工藝及其免疫調節作用，發現羧甲基茯苓多糖具有直接抑制或殺死腫瘤細胞、增強巨噬細胞吞噬、調節機體免疫功能的作用。武洪志等[10]研究黑曲菌發酵茯苓的工藝，發現經黑曲發酵后茯苓中多糖的含量顯著增加。然而黑曲菌發酵茯苓在增加茯苓多糖含量的同時，是否能夠改變茯苓多糖結構，從而改善其免疫調節作用，目前相關研究鮮有報道。研究以黑曲菌發酵后的茯苓多糖為原料，探究發酵茯苓多糖對免疫低下小鼠的免疫調節作用影響，為茯苓多糖的進一步開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茯苓：貴州省黎平縣；黑曲菌：貴州省農畜產品貯藏與加工重點實驗室；昆明小鼠：重慶騰鑫生物技術有限公司，6周～8周齡，雌雄各半，無特定病原體（specific pathogen free，SPF），體重 18 g～22 g，實驗動物合格證號為：SCXK（軍）2012-0011；免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、免疫球蛋白 M（immunoglobulin M，IgM）測定試劑盒：上海鼓臣生物技術有限公司；環磷酰胺：江蘇恒瑞醫藥股份有限公司。

1.2 儀器與設備

智能生化培養箱（SHP-250型）：上海光都儀器設備有限公司；紫外分光光度計（TU-1810型）：北京普析通用儀器有限責任公司；高速萬能粉碎機（FW100型）：天津市泰斯特儀器有限公司；臺式高速冷凍離心機（TGL20M型）：長沙邁佳森儀器設備有限公司；光吸收酶標儀（Spectra Max 190）：美谷分子儀器（上海）有限公司；倒置相差顯微鏡（MoticAE31型）：麥克奧迪實業集團有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵茯苓多糖制備

參照文獻發酵茯苓并提取茯苓多糖：取適量茯苓，在料水比 1 ∶0.93（g/mL），發酵時間 7.4 d，發酵溫度32℃，初始pH值為5.5，接種量為4%的條件下發酵，獲得發酵茯苓[10]。取適量發酵茯苓，按照1∶20（g/mL）的料液比加入蒸餾水，沸水浴1 h，趁熱抽取濾液，濃縮后加入4倍量的85%的乙醇，于4℃冰箱中靜置過夜，離心除去上清液，沉淀物用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌后，冷凍干燥獲得發酵茯苓多糖樣品[11]。

1.3.2 免疫低下小鼠模型構建

將已適應生活1周的昆明小鼠隨機分為空白對照組（CK）、環磷酰胺模型組（cyclophosphamide，CY）、發酵茯苓多糖（fermented Poria cocos polysaccharides，FPCP）高劑量組、FPCP低劑量組4個組，每組小鼠10只。FPCP 高、低灌胃劑量分別為 100、50 mg/kg·BW。各組小鼠腹腔注射環磷酰胺溶液，劑量為60 mg/kg·BW，連續注射3 d，構建環磷酰胺所致小鼠免疫功能低下模型。CK組腹腔注射等劑量的生理鹽水。小鼠免疫功能低下模型建立后，FPCP高、低劑量組按照各自劑量灌胃，CK及CY組等劑量灌胃生理鹽水。

1.3.3 臟器指數測定

連續灌胃小鼠10天后稱取體質量并頸椎脫臼處死，在無菌條件下分離胸腺與脾臟并稱重。分別計算胸腺與脾臟指數：胸腺指數=10×胸腺質量（mg）/體質量（g）；脾臟指數=10×脾臟質量（mg）/體質量（g）。

1.3.4 血清溶血素水平測定

連續灌胃小鼠6天后，腹腔注射0.2 mL 2%的雞紅細胞懸浮液，在第10天眼球取血，1 500 r/min離心10 min，獲取血清，生理鹽水稀釋100倍。取血清稀釋液1 mL，加10%的雞紅細胞懸浮液0.5 mL、10%的補體（豚鼠血清）1 mL，混勻，于37℃下水浴30 min，置于0℃冰箱中止反應。將反應液在1 500 r/min條件下離心5 min，取離心上清液于450 nm波長下測定OD值，以生理鹽水作空白調零。

1.3.5 血清IgG與IgM含量測定

連續灌胃小鼠10 d，眼球取血，1 500 r/min離心10 min，取血清，然后按照IgG、IgM試劑盒的使用說明書進行含量測定。

1.3.6 單核-巨噬細胞吞噬率測定

連續灌胃小鼠6天后，于小鼠腹腔注射1 mL濃度為4%的淀粉肉湯，引誘巨噬細胞向腹腔聚集；2 h后，每只小鼠注射1%的雞紅細胞懸液1mL。等待2 h，頸椎脫臼處死，剪開腹壁皮膚，腹腔注射生理鹽水2mL，輕柔5 min，吸取腹腔液1 mL均勻涂于載玻片上，于37℃孵育30 min，用生理鹽水緩慢沖洗1 min，吹干，染色進行觀察。計數：顯微鏡下觀察，以巨噬細胞數200個為記數范圍，同時記數其中吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數，計算吞噬率，吞噬率=吞噬雞紅細胞的巨噬細胞/200。

1.3.7 統計學分析

采用IBM SPSS Statistics 24.0數據處理軟件對實驗數據進行統計分析，計量數據用±s表示。所測數據進行正態性檢驗，符合正態分布且方差齊的數據，采用單因素方差分析法及最小顯著差數法（least significant diffierence，LSD）進行多組數據比較；方差不齊時多組比較采用Dunnett's T3法；不服從正態分布的數據進行非參數檢驗分析。

2 結果與分析

2.1 FPCP對免疫低下小鼠臟器指數的影響

小鼠胸腺與脾臟圖見圖1，FPCP對免疫低下小鼠臟器指數的影響見表1。

圖1 小鼠胸腺與脾臟圖片Fig.1 Thymus and spleen pictures of mice

表1 FPCP對免疫低下小鼠臟器指數的影響（±s，N=10）Table 1 Effect of FPCP on organ index of immunocompromised mice

表1 FPCP對免疫低下小鼠臟器指數的影響（±s，N=10）Table 1 Effect of FPCP on organ index of immunocompromised mice

注：同列字母相同表示差異不顯著，不同表示差異顯著（P＜0.05）。

脾臟指數/（mg/g）CK 49.92±4.85a 90.11±7.26a CY 60 31.16±1.72c 44.13±1.77c CY+FPCP 60+50 34.55±1.31b 48.94±1.49b CY+FPCP 60+100 43.74±5.93a 88.61±3.54a組別 劑量/（mg/kg·BW）胸腺指數/（mg/g）

表1試驗數據顯示，CY模型組小鼠胸腺和脾臟指數明顯偏低，與CK正常組相比差異顯著（P＜0.05），具有統計學意義，提示CY對小鼠免疫器官有顯著的抑制作用，即環磷酰胺致小鼠免疫低下模型構建成功。發酵茯苓多糖高、低劑量組均可使免疫抑制小鼠的胸腺指數和脾臟指數得到不同程度的升高，且呈現劑量效應，說明發酵茯苓多糖對免疫抑制小鼠的胸腺指數和脾臟指數有很強的恢復促進作用。FPCP高劑量組能顯著提高免疫抑制小鼠的胸腺指數和脾臟指數，雖然不能完全使其恢復到正常小鼠的數據狀態，但與CK正常組比較無顯著性差異（P＞0.05），且高劑量組脾臟指數升高程度與CK正常組相當。

2.2 FPCP對免疫低下小鼠血清溶血素水平的影響

FPCP對免疫低下小鼠血清溶血素水平的影響見表2。

表2 FPCP對免疫低下小鼠血清溶血素水平的影響（±s，N=10）Table 2 Effect of FPCP on serum hemolysin level in immunocompromised mice

表2 FPCP對免疫低下小鼠血清溶血素水平的影響（±s，N=10）Table 2 Effect of FPCP on serum hemolysin level in immunocompromised mice

注：同列字母相同表示差異不顯著，不同表示差異顯著（P＜0.05）。

組別劑量/（mg/kg·BW）溶血素水平（OD450）CK 0.65±0.08a CY 60 0.21±0.11c CY+FPCP 60+50 0.42±0.03b CY+FPCP 60+100 0.53±0.12a

由表2可見，CY模型組小鼠血清溶血素水平較CK正常組明顯降低，僅為CK組的32.31%，且差異顯著（P＜0.05），具有統計學意義，提示CY對小鼠血清溶血素水平有顯著抑制作用，即環磷酰胺致小鼠免疫低下模型構建成功。高、低劑量的發酵茯苓多糖組小鼠血清溶血素水平與CY組比較均差異顯著（P＜0.05），表明發酵茯苓多糖能有效提高環磷酰胺致免疫低下小鼠血清中溶血素含量，且呈現劑量效應。100 mg/kg高劑量發酵茯苓多糖組溶血素水平為CK正常組的81.54%，表明高劑量發酵茯苓多糖具有很好的提高小鼠血清溶血素的作用。

2.3 FPCP對免疫低下小鼠血清IgG、IgM含量的影響

FPCP對免疫低下小鼠血清IgG、IgM含量的影響見表3。

表3 FPCP對免疫低下小鼠血清IgG、IgM含量的影響（±s，N=10）Table 3 Effect of FPCP on serum IgG and IgM in immunocompromised mice

表3 FPCP對免疫低下小鼠血清IgG、IgM含量的影響（±s，N=10）Table 3 Effect of FPCP on serum IgG and IgM in immunocompromised mice

注：同列字母相同表示差異不顯著，不同表示差異顯著（P＜0.05）。

IgM含量/（mg/mL）CK 13.16±0.13a 1.97±0.23a CY 60 7.06±1.38d 1.18±0.02c CY+FPCP 60+50 9.98±0.41c 1.54±0.07b CY+FPCP 60+100 12.79±0.12b 1.95±0.14a組別 劑量/（mg/kg·BW）IgG含量/（mg/mL）

由表3可見，CY模型組小鼠血清IgG與IgM含量較CK正常組明顯降低，分別僅為CK組的53.65%、59.90%，且差異顯著（P＜0.05），具有統計學意義，提示CY對小鼠血清中IgG、IgM含量有顯著抑制作用，即環磷酰胺致小鼠免疫低下模型構建成功。發酵茯苓多糖高低劑量組IgG、IgM含量較CY組均明顯提高，差異顯著（P＜0.05），表明發酵茯苓多糖對小鼠血清IgG、IgM含量有顯著提升作用，且呈現劑量效應。高劑量發酵茯苓多糖組IgG、IgM含量分別為CK正常組的97.19%、98.98%，相比之下，高劑量發酵茯苓多糖對小鼠血清中IgM含量的提升作用比對IgG更為明顯。

2.4 FPCP對免疫低下小鼠單核-巨噬細胞吞噬率的影響

小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞情況見圖2，FPCP對免疫低下小鼠單核-巨噬細胞吞噬率的影響見表4。

圖2 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞情況Fig.2 Absorption of chicken red blood cells by mouse peritoneal macrophages

表4 FPCP對免疫低下小鼠單核-巨噬細胞吞噬率的影響（±S，N=10）Table 4 Effect of FPCP on phagocytosis of mononuclear macrophages in immunocompromised mice

表4 FPCP對免疫低下小鼠單核-巨噬細胞吞噬率的影響（±S，N=10）Table 4 Effect of FPCP on phagocytosis of mononuclear macrophages in immunocompromised mice

注：同列字母相同表示差異不顯著，不同表示差異顯著（P＜0.05）。

組別劑量/（mg/kg·BW）吞噬率/%CK 50.47±5.85a CY 60 31.38±5.63c CY+FPCP 60+50 42.47±2.66b CY+FPCP 60+100 45.19±5.74ab

由表4可知，CY模型組小鼠巨噬細胞吞噬率較CK正常組明顯降低，僅為CK組的62.18%，且差異顯著（P＜0.05），具有統計學意義，提示CY對小鼠巨噬細胞吞噬率有顯著抑制作用，即環磷酰胺致小鼠免疫低下模型構建成功。高、低劑量的發酵茯苓多糖組小鼠吞噬細胞吞噬率分別為CY組的1.44倍與1.35倍，且與CY組均差異顯著（P＜0.05），表明發酵茯苓多糖能有效提高環磷酰胺致免疫低下小鼠巨噬細胞吞噬率。發酵茯苓多糖高劑量組巨噬細胞吞噬率與CK正常組無顯著差異，為CK正常組的89.54%，表明高劑量發酵茯苓多糖能有效提高免疫低下小鼠的腹腔巨噬細胞吞噬率。

3 結論與討論

研究表明，給小鼠皮下注射環磷酰胺60mg/kg·BW，連續3次，可使小鼠臟器指數、血清溶血素水平、IgG和IgM含量以及巨噬細胞吞噬率明顯下降，說明小鼠的免疫功能受到抑制，免疫低下模型構建成功，給免疫低下模型小鼠灌胃高低劑量（100、50 mg/kg·BW）發酵茯苓多糖，小鼠臟器指數、血清溶血素水平、IgG和IgM含量以及巨噬細胞吞噬率明顯提高，且與環磷酰胺模型組差異顯著，說明發酵茯苓多糖可顯著緩解環磷酰胺對小鼠免疫功能的抑制作用。彭小彬等[12]研究報道了茯苓多糖對環磷酰胺致免疫低下小鼠的免疫調節作用，發現灌胃100 mg/kg·BW的茯苓多糖能有效提高小鼠血清溶血素水平及IgG與IgM含量，分別達到CK正常組的72.26%、96.53%、76.91%。本試驗結果與該報道結果一致，且經黑曲霉發酵后的茯苓多糖對小鼠溶血素水平及IgG與IgM含量的提高作用強于該報道中未發酵的茯苓多糖。胸腺和脾臟是重要的免疫器官，其臟器指數可以在一定程度上反應機體免疫功能的強弱。胸腺的主要功能是產生T淋巴細胞和分泌胸腺素，主要參與細胞免疫。脾臟中含有豐富的淋巴細胞和巨噬細胞，主要參與體液免疫[13]，表1結果顯示，灌胃100 mg/kg BW劑量的發酵茯苓多糖能有效恢復免疫抑制小鼠的臟器指數，胸腺與脾臟指數分別達正常水平的87.62%、98.34%，表明發酵茯苓多糖有較好的增強免疫抑制小鼠的免疫調節作用。單核-巨噬細胞能對外來異物進行識別和清除，具有強大的吞噬殺傷作用，吞噬率可以反映機體非特異性免疫功能的強弱[14]，發酵茯苓多糖能顯著增強免疫低下小鼠非特異性免疫調節功能。

自然界中的多糖多為混合物，具有單糖組成不同、結構差異明顯的特性[15]。對多糖類物質的生物活性研究，既包括藥物化學研究方面，從提取粗多糖（包括去除色素、游離蛋白、小分子雜質）到通過離子交換柱、大孔徑樹柱色譜層析法對不同多糖組分進行分離純化的過程，也伴隨著藥效學研究方面，從粗多糖層次證實活性，到各分離純化階段對不同多糖組分進行活性追蹤與篩選[16]。通過觀察經黑曲發酵后茯苓多糖對環磷酰胺致免疫低下小鼠免疫功能的免疫調節作用，初步提示發酵茯苓多糖在一定濃度范圍，具有激活機體固有性和適應性免疫的生物活性，為進一步開展發酵茯苓多糖的生物活性與機制研究提供了研究基礎。