富硒糙米抗氧化肽酶法制備工藝優化

杜潤峰，趙爽，劉昆侖，陳復生

（河南工業大學糧油食品學院，河南鄭州450001）

越來越多的研究表明，人類的衰老、慢性病和退行性疾病，如癌癥、心臟病、帕金森病等，其發生、發展過程與活性氧（reactive oxygen species，ROS）有關[1]。典型的活性氧有超氧化物陰離子、過氧化氫、羥基自由基、過氧化氫自由基和次氯酸根離子；過氧亞硝酸鹽是典型的活性氮 （the reactive oxygen/nitrogen species，RNS）[2]。為了清除多余的自由基，保持人體內穩態的平衡以及預防疾病，需要在飲食中攝入適當的抗氧化劑?？寡趸模╝ntioxidative peptides）是目前國內外研究較多的一種生物活性肽，具有抑制、延緩脂質氧化，保護人體組織器官免受自由基侵害的作用。近年來國內外研究者從大米蛋白[3]、甘薯[4]、大麻種子[5]和玉米面筋蛋白[6]中分離純化制備得到抗氧化肽，并鑒定了其序列。

硒是人體必需的微量元素，以硒代半胱氨酸（Se－Cys）的形式存在于蛋白質中作為硒酶的活性中心，發揮重要的抗氧化功能[7]。迄今為止，在人體基因組中至少已鑒定出25種硒蛋白，雖然多數硒蛋白的生物學功能尚未完全揭曉，但其中12種硒蛋白具有抗氧化作用[8]。因此，硒的抗氧化研究一直是國內外學者關注的焦點。

本研究以富硒糙米為原料，以抗氧化能力指數為指標，通過酶解富硒糙米蛋白制備抗氧化肽，并采用響應面法建立最佳制備工藝，為富硒糙米蛋白酶解物進行構效關系研究提供依據；同時可發揮硒元素和肽兩者的功能特性，在食品、醫藥領域有較好的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

水稻（隆粳968）：安徽隆平高科種業有限公司；堿性蛋白酶（189.57 U/mg）、中性蛋白酶（107.39 U/mg）、胃蛋白酶（28.63 U/mg）和風味酶（21.55 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司；熒光素二鈉鹽（fluorescein disodium salt，FL）：美國 Sigma-Aldrich 試劑公司；2，2-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽 [2，2-azobis（2-methylpropionamide）-dihydrochloride，AAPH]：Adama 試劑有限公司；6-羥基-2，5，7，8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸（6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）：東京化成工業株式會社；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

恒溫恒濕培養箱（HWS-250）：上海精宏實驗設備有限公司；礱谷機（6LN300-40X）：廣州市邦民機械設備廠；高速萬能粉碎機（FW177）、電熱恒溫水浴鍋（XMTD-7000）：北京市永光明醫療儀器有限公司；高速冷凍離心機（GL-10000C）：上海安亭科學儀器廠；可見分光光度計（722S）：上海儀電分析儀器有限公司；六聯電動攪拌器（JJ-6A）：常州普天儀器制造有限公司；冷凍干燥機（LGJ-25C）：北京四環科學儀器廠有限公司；數顯水浴恒溫振蕩器（SHZ-82）：常州博遠實驗分析儀器廠；pH計（PHS-3C）：上海儀電科學儀器股份有限公司；熒光分析儀（Flx 800）：美國伯騰儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 富硒糙米的制備

富硒糙米參照Liu等[9]的方法制得，硒含量為6.26 μg/g。

1.2.2 糙米抗氧化肽制備工藝

富硒糙米→粉粹（過100目篩）→正己烷脫脂7 h[1 ∶3（g/mL）]→揮干→蒸餾水浸泡 12 h[1 ∶3（g/mL）]→攪拌為懸浮液→0.1 mol/L的NaOH溶液浸提2 h（懸浮液：NaOH溶液=1∶3，體積比）→離心30min（4000r/min）→上清液調pH值→離心20 min→沉淀、洗滌→冷凍干燥→富硒糙米蛋白

富硒糙米蛋白（控制一定的底物濃度）→調節pH值→攪拌（37℃，15 min）→酶解→滅酶（90℃，10 min）→離心15 min（8 000 r/min）→收集上清液（測定水解度及抗氧化能力指數）→冷凍干燥

1.2.3 水解度（degree of hydrolysis，DH）測定

DH測定采用茚三酮比色法[10，15]。

1.2.4 抗氧化能力指數（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）法

ORAC方法測定抗氧化劑的作用原理是一種經典的通過抑制氫轉移反應過程終止自由基鏈式反應，與鐵還原抗氧化能力（ferric reducing ability of plasma，FRAP）、抗氧化能力（trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC） 及 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl，DPPH）等其他方法相比，ORAC法可以提供穩定可控的自由基，與生命現象中的自由基具有高度的一致性[11]。ORAC測定方法參照Davalos等[12]的方法進行改進，簡要過程如下：以FL為熒光素探針，Trolox為標準抗氧化劑，AAPH為自由基引發劑。所有試劑均采用75 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）進行配制。在黑色96孔板中分別加入20 μL的磷酸鹽緩沖液（空白組），不同濃度的Trolox溶液（標準對照組）和待測樣品溶液（樣品組），然后加入120 μL FL溶液（最終濃度為70 nmol/L），在37℃下保溫15 min后，快速加入60μLAAPH溶液（最終濃度為12mmol/L）。采用酶標儀在激發波長為485 nm，發射波長為528 nm條件下測定其熒光強度，程序設置為每1分鐘讀數1次，共讀120 min，每次讀數前振蕩10 s。ORAC值以Trolox當量（trolox equivalent，TE）表示，單位為 μmol TE/g。首先計算出熒光強度衰退曲線面積（the net area under the curve，AUC），計算公式如下：

式中：f0表示時間為0 min時的熒光強度，fi表示第i分鐘時的熒光強度。

ORAC值的計算公式如下：

式中：AUCSample、AUCBlank和 AUCTrolox分別表示待測樣品，空白組和標準抗氧化劑組的AUC值。

1.2.5 單因素試驗

不同蛋白酶對富硒糙米蛋白的酶解條件如表1所示，測定酶解產物的DH和ORAC值，篩選出最佳蛋白酶。在此基礎上考查底物濃度、pH值、溫度和加酶量對DH及抗氧化活性的影響。

表1 不同蛋白酶的水解條件Table 1 Hydrolysis condition of different proteases

1.2.6 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken設計原理，設計了三因素三水平的響應面試驗，確定富硒糙米蛋白酶解的最佳工藝條件。以酶解物的ORAC（Y）為考察指標，酶解時間（X1）、溫度（X2）和加酶量（X3）為自變量，因素水平編碼表見表2。

表2 因素水平編碼表Table 2 Code and level of facters chosen

1.2.7 數據處理

試驗重復3次，結果采用SPSS（V.21）進行統計分析，均值比較采用Duncan’s方法；響應面設計采用Design Expert（V.8.0.6）軟件進行；顯著性檢驗水平：*為顯著，P＜0.05，** 為極顯著，P＜0.01。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 蛋白酶種類對富硒糙米抗氧化肽活性的影響

蛋白酶種類對富硒糙米蛋白水解度及產物抗氧化活性的影響見圖1。

圖1 蛋白酶種類對富硒糙米蛋白水解度及產物抗氧化活性的影響Fig.1 Effect of enzyme species on DH and antioxidant activity of hydrolysates of Se-BR protein

蛋白酶解產物的抗氧化特性主要取決于蛋白酶的特異性、DH和釋放肽的性質，如分子量和氨基酸組成[13]。水解度均隨時間的延長均呈現先升高后趨于平穩的趨勢。風味酶的水解能力強于堿性蛋白酶和中性蛋白酶，胃蛋白酶水解能力較弱（圖1A）。

具有特定功能的活性肽往往是分子量較小的短肽，但水解度過高，必然會產生較多的游離氨基酸，因此，應以糙米蛋白酶解物的抗氧化指數作為評價指標[14]。由圖1B可知，中性蛋白酶水解產物的抗氧化活性略高于堿性蛋白酶，而胃蛋白酶和風味酶水解產物的抗氧化活性較低。這可能是由于胃蛋白酶主要水解含有相鄰于芳香族氨基酸或二羧基氨基酸肽鍵的多肽。中性蛋白酶水解產物的抗氧化活性在水解前期隨時間的延長呈現上升趨勢，但水解時間達到120分鐘后，水解產物的抗氧化活性無顯著變化。因此，選用中性蛋白酶為最佳酶源制備富硒糙米抗氧化肽，且控制酶解時間為120 min。

2.1.2 pH值對富硒糙米抗氧化肽活性的影響

pH值對富硒糙米抗氧化肽活性的影響見圖2。

由圖2可知，中性蛋白酶的水解效率以及水解產物的抗氧化活性隨pH值增加呈逐漸上升趨勢，且酸性條件下均較低；當pH值大于8.0后，DH和抗氧化活性無顯著變化，因此確定pH為8.0為中性蛋白酶的較優條件。這可能是由于pH值影響維持酶分子空間結構有關基團的解離，從而影響了酶活性部位的構象，進而影響蛋白酶的活性。

圖2 pH值對富硒糙米蛋白酶解產物抗氧化活性的影響Fig.2 Effect of pH on DH and antioxidant activity of hydrolysates of Se-BR protein

2.1.3 底物濃度對富硒糙米抗氧化肽活性的影響

底物濃度對富硒糙米蛋白酶解產物抗氧化活性的影響見圖3。

圖3 底物濃度對富硒糙米蛋白酶解產物抗氧化活性的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on DH and antioxidant activity of hydrolysates of Se-BR protein

由圖3可知，富硒糙米蛋白水解產物的抗氧化活性及水解度隨底物濃度的增加均呈現先增大后降低的趨勢。當底物濃度為3%時，富硒糙米蛋白酶解產物的ORAC值和水解度均達到最大值，分別為（1 111.34±10.36）μmol TE/g和（11.21±0.18）%。當蛋白濃度較低時，底物能與蛋白酶充分接觸，增加底物濃度能夠促進多肽的生成，當底物濃度達到飽和點后，繼續增加底物濃度會抑制蛋白酶的水解效率[15]。

2.1.4 加酶量對富硒糙米抗氧化肽活性的影響

加酶量對富硒糙米抗氧化肽活性的影響見圖4。

圖4 加酶量對富硒糙米蛋白酶解產物抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on DH and antioxidant activity of hydrolysates of Se-BR protein

當加酶量較低時，富硒糙米蛋白酶解產物的抗氧化活性和水解度隨加酶量的增加呈顯著增加的趨勢。當加酶量大于8 000 U/g時，雖然水解度仍顯著增加，但是抗氧化活性趨于穩定。且當加酶量大于16 000 U/g時，抗氧化活性略有下降。張輝等[16]在超聲輔助酶解制備麥麩抗氧化肽時發現，隨著木瓜蛋白酶的增加，自由基清除能力呈先升高后降低趨勢。這可能是由于蛋白酶添加過量時，會使蛋白質過度水解，得到分子量更小的肽段或游離氨基酸，導致具有抗氧化活性的多肽含量降低。

2.1.5 溫度對富硒糙米抗氧化肽活性的影響

溫度對富硒糙米抗氧化肽活性的影響見圖5。

圖5 溫度對富硒糙米蛋白酶解產物抗氧化活性的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on DH and antioxidant activity of hydrolysates of Se-BR protein

由圖5可知，酶解產物的抗氧化活性和水解度隨溫度的增加先升高后趨于平緩。這是由于溫度對酶解反應速度的影響是雙重的，在一定的溫度范圍內，蛋白酶的活性隨溫度的升高而增加，因此水解度會呈現增強的趨勢。但是當溫度過高時，蛋白酶會變性失活，酶解能力降低。

2.2 響應面試驗設計及結果分析

在單因素試驗的基礎上，選擇中性蛋白酶水解富硒糙米蛋白。固定底物濃度為3%、pH值為8.0，選擇酶解時間、酶解溫度和加酶量為考察因素，根據Box-Behnken原理進行響應面試驗，結果見表3，方差分析見表4。采用Design-Expert（V.8.0.6）軟件對試驗結果進行多元回歸擬合，得到回歸方程為：

表3 響應面優化試驗設計及結果Table 3 Respond surface experimental design and results

表4 回歸方程各項方差分析Table 4 ANOVA analysis of regression equation

由表 4可知，回歸模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P=0.509 7），并且該模型R2=93.68%，說明該模型的擬合度好，自變量和響應值之間線性關系顯著，可以用于該反應的理論推測。此外，F檢驗可反映各因子的貢獻率，F值越大，表明對試驗結果的影響越顯著，由此可知，各因素對多肽抗氧化活性的影響順序為：加酶量＞溫度＞時間。

三維響應面圖可更直觀的顯示因素間交互作用對因變量的影響，并可預測各因素的最優水平；而二維等高線圖即三維響應面圖在底面的投影圖，其形狀表明變量間交互作用的強弱，橢圓等高線表明變量間的有較強的交互作用，而圓形等高線表明交互作用較弱[17]。圖6是酶解溫度為零水平（45℃）時，酶解時間（X1）和加酶量（X3）的響應面圖和等高線圖。隨著加酶量的增加，ORAC值顯著增加。而酶解時間（X1）和溫度（X2）的交互作用及溫度（X2）和加酶量（X3）的交互作用對酶解產物的抗氧化活性無顯著性影響。

圖6 因素交互作用對富硒糙米蛋白水解產物抗氧化活性的影響Fig.6 Effect of factors interaction on antioxidant activity of hydrolysates of Se-BR protein

由Design-Expert分析得最佳酶解條件為：酶解時間69 min、酶解溫度55℃、加酶量12 000 U/g。根據實際操作條件，將最佳試驗條件設定為底物濃度3%、pH 8.0、酶解時間69 min、酶解溫度55℃、加酶量12 000 U/g。在此條件下，富硒糙米蛋白酶解產物的抗氧化能力為（1 232.57± 62.34）μmol TE/g，與預測值1 219.76 μmol TE/g相近，說明通過響應面法優化得到最佳酶解條件可靠。

2.3 富硒糙米抗氧化肽與非富硒糙米抗氧化肽的活性比較

在最佳酶解條件下對同源非富硒糙米蛋白進行酶解，通過ORAC值測定其抗氧化活性，并以谷胱甘肽作為對照，結果如圖7所示。富硒糙米酶解物的ORAC值為（1 232.57±62.34）μmol TE/g，約為谷胱甘肽抗氧化活性的68.87%，具有較強的抗氧化活性；而非富硒糙米酶解物的 ORAC 值為（975.26±78.99）μmol TE/g，約為谷胱甘肽抗氧化活性的54.49%，顯著低于富硒糙米蛋白酶解物。說明硒對肽的抗氧化能力具有協同促進作用，但其協同作用機理仍需進一步研究。

圖7 富硒糙米酶解物與非富硒糙米酶解物的抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activity of Se-BR hydrolysate and non-Se-BR hydrolysate

3 結論

通過比較不同蛋白酶對富硒糙米蛋白質酶解物的水解度和抗氧化能力指數，發現中性蛋白酶水解產物的抗氧化活性最強，其次是堿性蛋白酶。在單因素的基礎上，通過響應面優化富硒糙米蛋白質的水解工藝。結果表明：富硒糙米抗氧化肽制備工藝的影響主次順序為：加酶量＞溫度＞時間，其最優條件為底物濃度3%，pH 8.0，酶解時間69 min，酶解溫度55℃，加酶量12 000 U/g。在此條件下ORAC值為（1 232.57±62.34）μmol TE/g，與預測值 1 219.76 μmol TE/g 相近。富硒糙米蛋白酶解物具有顯著的抗氧化活性，可以作為天然抗氧化劑來抵御氧化應激，也可作為補硒的營養強化劑，用于食品、醫療等領域。