響應面法優化紫甘藍中花色苷提取工藝及抗氧化性研究

張笑菊，蔡逸安，李昕悅，吳棟磊，徐曉陽，朱迎春

（山西農業大學食品科學與工程學院，山西太谷030801）

紫甘藍，又名紫卷心菜，屬十子花科（Cmciferae），原產歐洲地中海地區，現在我國大部分地區都有栽種，具有營養豐富、易種、易采、產量大、生長期短、適應性強、價格低廉等特點[1]。

紫甘藍中含有大量天然色素，其中呈紫色的主要成分是花色苷，是由花青素在自然狀態下與各種糖及有機酸結合形成的糖苷，是良好的天然色素，除了做食品添加劑外，還有一定的藥用價值[2]。大量研究表明：花色苷具有很強的抗氧化作用[3]，可以清除體內的自由基，降低氧化酶的活性，降低甘油酯水平[4]，降低低密度脂蛋白中膽固醇含量[5]，改善脂蛋白的分解代謝，抑制膽固醇吸收[6]，是治療糖尿病性視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）的有效分子，可以預防多種心血管疾病[7-8]。

有機溶劑萃取法被廣泛的應用于色素的提取，根據相似相溶原理，提取極性分子花色苷通常使用的提取劑有甲醇、乙醇、丙酮、水等。為了防止提取過程中非酰基化的花色苷的降解，常在提取溶液中加入一定量的鹽酸、磷酸等無機酸或酒石酸、檸檬酸等有機酸[9-10]。胡彥新采用單因素試驗和三因素三水平的響應面分析法優化桑葚酒渣中花色苷的提取工藝為：加酶量0.2%、提取溫度64℃、提取時間145 min，在此試驗條件下花色苷的提取率為4.68 mg/g[11]。孟憲軍用酸性乙醇作為提取劑，采用響應面分析優化法優化藍莓花色苷提取工藝為：提取液乙醇體積分數60.65%，料液比1∶20.65（g/mL），提取時間122.53 min，提取溫度 50℃[12]。

本試驗以紫甘藍為原料，研究乙醇濃度、料液比、pH值、提取溫度和提取時間等因素對花色苷提取率的影響，利用單因素試驗和響應面法優化紫甘藍花色苷的提取工藝，并對其抗氧化性進行測定，以期為后期紫甘藍花色苷的開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮紫甘藍：山西農業大學菜市場；95%乙醇、鹽酸、氯化鉀、三水合乙酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯化鐵、三氯乙酸、K3[Fe（CN）6]、DPPH、無水乙醇、2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[diammonium 2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate），ABTS]、過硫酸鉀（均為分析純）：天津市化學試劑一廠。

1.2 儀器與設備

7200型分光光度計：龍尼柯上海儀器有限公司；FA2004電子分析天平：上海華巖儀器設備有限公司；ST2100 pH計：奧豪斯儀器（常州）有限公司；LD5-2B低速離心機：北京雷勃爾醫療器械有限公司；HH恒溫水浴鍋：余姚市東方電工儀器廠；101-2電熱恒溫鼓風干燥箱：上海躍進機械廠。

1.3 試驗設計與方法

1.3.1 原料處理

將新鮮紫甘藍洗凈晾干切碎，置于40℃鼓風干燥箱中烘干，研磨成粉，80目濾網過篩備用。

1.3.2 紫甘藍中花色苷的提取

取錐心瓶加入一定量的乙醇為提取溶劑，置于水浴鍋中預熱，用稀鹽酸預調pH值，稱取定量紫甘藍粉加入錐心瓶中，調節pH值，恒溫水浴浸提。將浸提液用100目尼龍布過濾，濾液4 000 r/min條件下離心10 min，取上清液為待檢樣品。

1.3.3 花色苷含量的測定[13-14]

花色苷含量的測定采用紫外pH示差法，即在不同pH值下，花色苷基團發生變化，掃描紫外-可見光譜時，花色苷最大吸收峰發生相應的改變。將待測樣品用pH 1.0 KCl溶液（0.025 mol/L）和pH 4.5乙酸鈉緩沖溶液（0.4 mol/L）稀釋到合適倍數，室溫下避光平衡110 min，以蒸餾水作空白，分別在518 nm和700 nm波長處測定吸光度值，根據公式（1）、（2）計算樣品中花色苷含量。45℃）對其提取率的影響，確定最佳溫度。

式中：Mw為花色苷的摩爾分子量，449.2 g/mol；DF為稀釋倍數；ε為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的摩爾消光系數，26 900 L/（mol·cm）；L為光程，0.5 cm；A518和A700分別為518 nm和700 nm處的吸光值。

1.3.4 單因素試驗設計

1.3.4.1 乙醇濃度對提取率的影響

在固定料液比 1 ∶35（g/mL）、pH 2.0、提取溫度 40 ℃和提取時間3 h條件下，考察不同的乙醇濃度（30%、40%、50%、60%、70%）對花色苷提取率的影響，確定最佳乙醇濃度。

1.3.4.2 料液比對提取率的影響

在固定乙醇濃度40%、pH 2.0、提取溫度40℃和提取時間3 h條件下，考察不同的料液比[1∶25、1∶30、1 ∶35、1 ∶40、1 ∶45（g/mL）]對其提取率的影響，確定最佳料液比。

1.3.4.3 pH值對提取率的影響

在固定乙醇濃度40%、料液比1∶35（g/mL）、提取溫度40℃和提取時間3 h條件下，考察不同的pH值（1、2、3、4、5）對其提取率的影響，確定最佳 pH 值。

1.3.4.4 溫度對提取率的影響

在固定乙醇濃度40%、料液比1∶35（g/mL）、pH 2.0和提取時間3 h條件下，考察不同的溫度（30、35、40、

1.3.4.5 時間對提取率的影響

在固定乙醇濃度40%、料液比1∶35（g/mL）、pH 2.0和提取溫度40℃條件下，考察不同的提取時間（1、2、3、4、5 h）對其提取率的影響，確定最佳提取時間。

1.3.5 響應面試驗設計

固定提取時間3 h和pH 2.0條件下，選取乙醇濃度、料液比和提取溫度3個因素為自變量，以每克紫甘藍粉中提取的花色苷毫克數為指標，進行Box-Behnken試驗，試驗因素及水平編碼見表1。

表1 響應面試驗因素水平及編碼Table 1 Factor level and coding of response surface methodology experiment

1.4 紫甘藍花色苷抗氧化活性的研究

1.4.1 總還原力的測定[15]

取0.5 mL待測溶液，0.6 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6），1.5 mL 1.0%K3[Fe（CN）6]置于具塞試管中，迅速混勻，置于50℃水浴中反應20 min，冰水冷卻，再加3 mL10%三氯乙酸，混勻后，取出3 mL上清液，加5 mL雙蒸水和0.2 mL 0.1%FeCl3，混勻測定各樣品在700 nm下的吸光度值A1，作為紫甘藍的空白對照；然后取 1.5 mL 蒸餾水代替 1.5 mL1.0%K3[Fe（CN）6]，測定其在700 nm下的吸光度值A2。紫甘藍花色苷溶液的總還原力為A0=A1-A2。

1.4.2 DPPH自由基清除率的測定[16]

取1×10-4mol/L DPPH溶液3 mL，加入2 mL復合果蔬汁，搖勻，室溫、避光保存下反應20 min，以50%乙醇做空白對照，在517 nm波長下測定吸光度，得吸光度A1。另取3 mLDPPH溶液與2 mL的無水乙醇溶液混合，步驟同上，測得吸光度A2。用2 mL無水乙醇代替DPPH溶液，與3 mL復合果蔬汁混合，避光反應20 min，517 nm下測得吸光度A3，然后按下式計算DPPH自由基清除率。

1.4.3 ABTS+自由基清除率的測定[17-18]

取 5 mL7 mmol/LABTS溶液與 88 μL140 mmol/L過硫酸鉀溶液混合，室溫、避光條件下靜置過夜，形成ABTS+儲備液。使用前，用水適當稀釋成工作液，要求其在734 nm下的吸光度值為0.7±0.002。取2 mL花色苷樣品（用蒸餾水稀釋至一定濃度），加入8 mLABTS工作液，混合10 s，在30℃下靜置6 min，于734 nm下測定吸光度，得吸光度值A1；空白組用2 mL水代替樣品溶液，步驟同上測得吸光度值A2；對照組將2 mL花色苷樣品液加入到8 mL蒸餾水中，搖勻、靜置，734 nm下得到吸光度值A3。ABTS+自由基的清除率公式如下：

1.5 數據處理

試驗均重復3次，結果用平均值±標準偏差表示。數據統計分析采用IBM SPSS Statistics 20.0和Statistix 8.1軟件包（St Paul，MN）進行單因素方差分析、差異顯著性檢驗，采用Design-Expert8.0.6軟件進行響應面分析，采用SigmaPlot 10.0繪圖軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 乙醇濃度對提取率的影響

圖1為乙醇濃度對花色苷提取率的影響。

圖1 乙醇濃度對花色苷提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of anthocyanin

由圖1可知，當乙醇濃度低于40%時，隨著乙醇濃度增加，花色苷提取率逐漸提高。乙醇濃度達到40%，花色苷提取率最高，為13.23 mg/g，當繼續增大乙醇濃度時，花色苷的提取率下降，這是因為隨著乙醇體積分數增大，提取劑極性變小，偏離了花色苷的極性，從而降低了花色苷的提取率。

2.1.2 料液比對提取率的影響

圖2為料液比對花色苷提取率的影響。

由圖2可知，料液比低于1∶35（g/mL）時，花色苷提取率隨著料液比的增加而增大。料液比為1∶35（g/mL）時，花色苷的提取率達到相對較大的數值14.40 mg/g，繼續增大料液比時，花色苷的提取率下降。當料液比大于1∶40（g/mL）時，反應體系較稀薄，既造成提取劑的浪費，也降低了花色苷的提取率。

圖2 料液比對花色苷提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of anthocyanin

2.1.3 pH值對提取率的影響

圖3為pH值對花色苷提取率的影響。

圖3 pH值對花色苷提取率的影響Fig.3 Effect of pH value the extraction rate of anthocyanin

由圖3可知，pH值低于2時，隨著pH值的升高，花色苷提取率增加。當pH值為2時，花色苷的提取率達到最高值3.85 mg/g，當繼續增大pH值時，花色苷的提取率顯著下降，當pH值達到5時，花色苷的提取率降低至12.31 mg/g。

2.1.4 溫度對提取率的影響

圖4為提取溫度對花色苷提取率的影響。

圖4 提取溫度對花色苷提取率的影響Fig.4 Effect of temperature on the extraction rate of anthocyanin

由圖4可知，在提取溫度低于40℃時，隨著提取溫度的升高，花色苷提取率逐漸增大并且在40℃時達到最高值13.26 mg/g，當提取溫度高于40℃時，花色苷的提取率反而下降。每一種色素都對溫度具有一定的耐受性，溫度過高會破壞色素的結構和性質，所以40℃為較佳提取溫度。

2.1.5 時間對提取率的影響

圖5為提取時間對花色苷提取率的影響。

圖5 提取時間對花色苷提取率的影響Fig.5 Effect of time on the extraction rate of anthocyanin

由圖5可知，提取時間低于3 h時，花色苷提取率隨著提取時間的延長而升高。提取時間為3 h時，花色苷的提取率較高，達到11.25 mg/g。提取時間繼續延長，花色苷提取率反而下降，這可能是因為時間的延長導致更多的花色苷發生氧化而損失的緣故。

2.1.6 5個單因素試驗的方差分析結果

表2為5個單因素試驗的方差分析表。

通過 Student-Newman-Keuls（SNK）法計算可知，5個試驗因素中的3個因素（溫度、料液比和乙醇濃度）對花色苷提取率影響顯著，是影響提取率的主要因素；而提取時間和pH值對花色苷提取率影響不顯著，是影響提取率的次要因素。

2.2 響應面法優化紫甘藍花色苷提取工藝

2.2.1 響應面模型的建立及其方差分析

雖然影響紫甘藍中花色苷提取率的因素很多，但通過表2可知：溫度、料液比和乙醇濃度是影響提取率的主要因素，因此，建立以溫度、料液比和乙醇濃度為因素水平的響應面試驗模型。采用Box-Behnken試驗結果見表3，利用Design Expert8.0.6進行多元回歸擬合，得到花色苷提取率（Y）對自變量X1（溫度）、X2（料液比）、X3（乙醇濃度）的回歸方程為：

表3 Box-Behnken響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of the Box-Behnken response surface experiment

表4為回歸模型的方差分析。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4可知，模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P=0.823 4），回歸模型的決定系數為0.991 6，說明該模型能解釋99.16%的變化。該模型擬合度良好，試驗誤差小，用該模型對紫甘藍花色苷提取工藝進行優化可以獲得良好的效果。模型一次項X1、X2、X3極顯著（P＜0.01），二次項 X12、X22、X32極顯著（P＜0.01），交叉項 X1X3、X2X3顯著（P＜0.05），X1X2不顯著。將二次回歸方程中的一次項F值作為各參數對花色苷提取率影響的比較依據，得出3因素對花色苷提取率影響的大小依次為：X2＞X3＞X1，即料液比＞乙醇濃度＞提取溫度。

2.2.2 交互效應分析

因素的交互作用可以從響應曲面坡度變化得到反映。響應面的坡度，表明紫甘藍花色苷提取量在處理條件發生變化時其響應的靈敏程度。如果響應面坡度非常陡峭，表明當處理條件發生變化時，響應值非常敏感；反之，如果響應面坡度非常平緩，說明提取指標的變異對響應值不敏感。

通過二次多項式回歸方程所得到的響應面交互效應如圖6所示。

圖6 交互效應圖Fig.6 Interactive effect

由圖6可知X1X3、X2X3對紫甘藍花色苷提取率的影響極顯著（P＜0.01），X1X2對紫甘藍花色苷提取率的影響不顯著。

2.2.3 最佳工藝條件的確定與驗證

將乙醇濃度、料液比、溫度的取值范圍分別設定為乙醇濃度為30%～50%，料液比為1∶30（g/mL）～1 ∶40（g/mL），溫度 30℃～50℃，并將目標值設定為最大值，通過Design Expert 8.0.6軟件獲得最優組合為乙醇濃度 41.17%、料液比 1∶35.77（g/mL）、溫度 41.13℃。在此最優組合中，理論最佳紫甘藍花色苷的提取率為14.01%，根據實際條件的限制將最優組合修正為：乙醇濃度 40%、料液比 1∶36（g/mL）、溫度 41.0℃，在此試驗條件下的提取率為13.92 mg/g，與預測值接近。

2.3 紫甘藍花色苷抗氧化性的結果與分析

2.3.1 總還原力的測定

紫甘藍花色苷的總還原能力見圖7。

圖7 紫甘藍花色苷的總還原能力Fig.7 Total reduction ability of anthocyanins from red cabbage

由圖7可以看出，在試驗所選濃度范圍內（30 mg/L～180 mg/L），吸光值隨著紫甘藍花色苷濃度的增大而增大，這說明紫甘藍花色苷的總還原能力（即抗氧化能力）隨著濃度的增大而增大。

2.3.2 DPPH自由基清除率的測定

紫甘藍花色苷對DPPH自由基的清除率見圖8。

圖8 紫甘藍花色苷對DPPH自由基的清除率Fig.8 Scavenging rates of red cabbage anthocyanin on DPPH free radicals

由圖8可以看出，在試驗所選濃度范圍內（30mg/L～180 mg/L），紫甘藍花色苷對DPPH自由基的清除率隨著紫甘藍花色苷濃度的升高，呈現折線上升的趨勢，當溶液濃度為150 mg/L時，清除能力達到了84.50%，說明紫甘藍花色苷具有較強的清除DPPH自由基的能力。

2.3.3 ABTS+自由基清除率的測定

紫甘藍花色苷對ABTS+自由基的清除率見圖9。

圖9 紫甘藍花色苷對ABTS+自由基的清除率Fig.9 Scavenging rates of red cabbage anthocyanin on ABTS+free radicals

由圖9可以看出，在試驗所選濃度范圍內（30mg/L～180 mg/L），紫甘藍花色苷對ABTS+自由基的清除率隨著紫甘藍花色苷濃度的升高而升高，當溶液濃度為150 mg/L時，清除能力達到了97%，由此可以看出紫甘藍花色苷具有較強的清除ABTS+自由基的能力。

3 結論

本試驗以花色苷提取率為考察目標，利用響應面分析法對紫甘藍花色苷的提取工藝進行優化，最終獲得花色苷提取最佳工藝條件為乙醇濃度為40%、料液比為1∶36（g/mL）、溫度41℃，在此試驗條件下花色苷的提取率為13.92 mg/g。通過總還原力的測定、清除DPPH自由基和ABTS+自由基的體外抗氧化試驗，證實紫甘藍花色苷具有較好的體外抗氧化能力。其抗氧化水平隨著濃度的增大而增加，尤其是對ABTS+自由基的清除能力較強，當紫甘藍花色苷濃度為150 mg/L時，清除能力達到了97%。