無(wú)花果酶解制汁工藝優(yōu)化及抗氧化活性

馬艷弘，田麗敏，孫小華，崔晉，金秋瓊，楊國(guó)慧

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京210014；2.蘇州西山國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范園區(qū)有限責(zé)任公司，江蘇蘇州215111；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

無(wú)花果（Ficus carica L.），別名天仙果、明目果、映日果、奶漿果，為桑科無(wú)花果屬多年生木本植物，是一種藥食兼優(yōu)植物，具有很高的藥用營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。無(wú)花果汁香氣濃郁、酸甜適口，既含有豐富的多糖、維生素、礦質(zhì)元素等，還含有多酚、黃酮等生物活性物質(zhì)，其果酒、飲料等相關(guān)產(chǎn)品在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)及其暢銷(xiāo)。

多酚是無(wú)花果汁中重要的活性成分[2-3]，具有抗氧化和清除自由基功能，在抗癌、抗衰老、預(yù)防心腦血管疾病等方面具有很好的療效[4-6]。據(jù)報(bào)道，果汁中植物多酚含量和種類(lèi)與其抗氧化能力密切相關(guān)。果汁制備的方法包括水浴法、壓榨法、離心法、酶法法、超聲波輔助法等[7-8]，其中酶解榨汁技術(shù)因其具有出汁率高、對(duì)果品中功能因子的提取效率高、果汁的生物活性高等優(yōu)點(diǎn)得到了廣泛運(yùn)用。因此本研究采用酶解技術(shù)制備無(wú)花果汁，并通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化無(wú)花果汁的最佳酶解制汁工藝并考察其體外抗氧化活性，為無(wú)花果汁的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)與試驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

布萊瑞克無(wú)花果：蘇州西山國(guó)家農(nóng)業(yè)示范有限責(zé)任公司。

纖維素酶（活力≥10 000 U/mg）、果膠酶（活力≥30 000 U/g）：合肥Biosharp生物科技有限公司；福林酚：上海源葉生物科技有限公司；DPPH：南京藤春生物科技發(fā)展有限公司；VC：西隴科學(xué)股份有限公司；羥自由基測(cè)試盒、總抗氧化能力試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（PL303型）：梅特勒-托利多（上海）有限公司；打漿機(jī)（MJ-BL15U11型）：廣東美的生活電器制造有限公司；電熱恒溫水浴鍋（DK-8D型）：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（D-8型）：上海奧析科學(xué)儀器有限公司；漩渦混合儀（XW-80A型）：海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 無(wú)花果酶解制汁工藝

稱(chēng)取適量無(wú)腐爛、無(wú)破損的同一成熟程度的無(wú)花果洗凈，打漿成無(wú)花果漿，分別添加一定量的纖維素酶或果膠酶酶解一定時(shí)間，酶解結(jié)束后于90℃下滅酶5 min，4 000 r/min離心30 min取上清液，沉淀再重復(fù)處理1次，合并2次上清液備用，按照下列公式（1）計(jì)算出汁率。

1.3.2 無(wú)花果汁中多酚含量測(cè)定[9]

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

配制濃度為1.0 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)母液；再稀釋為不同濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mg/mL）的對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取1 mL不同濃度的對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液，各加入5 mL蒸餾水和1 mL福林酚在避光下充分搖勻反應(yīng)，再加入4 mL的5%碳酸鈉溶液，避光下混勻漩渦，45℃避光水浴1.5 h，冷卻，測(cè)定波長(zhǎng)760 nm處的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到回歸方程為y=0.010 9x+0.002 1（R2=0.999 6）。

1.3.2.2 無(wú)花果汁中多酚含量的測(cè)定

精密吸取1 mL的無(wú)花果汁10倍稀釋液，分別加入5 mL蒸餾水和1 mL福林酚在避光下充分搖勻反應(yīng)，再加入4 mL的5%碳酸鈉溶液，避光下混勻漩渦，45℃避光水浴1.5 h，冷卻，測(cè)定波長(zhǎng)760 nm處的吸光值。以吸光值為Y值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算無(wú)花果汁中多酚含量。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別考察不同纖維素酶添加量分別為（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%），不同果膠酶添加量分別為（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%），不同酶解溫度（35、40、45、50、55、60、65 ℃），不同酶解時(shí)間（30、60、90、120、150、180 min）對(duì)無(wú)花果出汁率及汁多酚含量的影響，根據(jù)結(jié)果確定適宜的制汁條件。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以纖維素酶添加量、果膠酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間為試驗(yàn)因素，以出汁率與多酚含量為響應(yīng)值，采取BOX-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)進(jìn)行四因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)[10]，通過(guò)Design-Expert 8.06軟件優(yōu)化酶解制汁工藝參數(shù)。各因素的水平表見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平編碼表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

1.3.5 無(wú)花果汁體外抗氧化活性測(cè)定[11-12]

1.3.5.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

配置0.05 mg/mL的DPPH自由基溶液，根據(jù)無(wú)花果中的多酚含量稀釋果汁，使其果汁中多酚含量分別0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL，取不同體積的多酚溶液以及同濃度的VC溶液，加去氧水補(bǔ)足1 mL，分別加入5 mL DPPH溶液，混合均勻后避光反應(yīng)30 min，用分光光度計(jì)分別測(cè)定517 nm處的吸光值A(chǔ)1，5 mL DPPH溶液與1 mL無(wú)水乙醇混合后測(cè)得的吸光度A0，5 mL無(wú)水乙醇與1 mL多酚溶液混合后測(cè)得的吸光度A2。按照公式（2）計(jì)算不同多酚濃度下無(wú)花果汁的DPPH自由基清除率。

式（2）中：A1為樣品組吸光度；A2為對(duì)照組吸光度；A0為空白組吸光度。

1.3.5.2 羥自由基清除率的測(cè)定

根據(jù)無(wú)花果中的多酚含量稀釋果汁，使其果汁中多酚含量分別 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，分別取500 μL含不同質(zhì)量濃度多酚的無(wú)花果汁和VC溶液，測(cè)定550 nm處的吸光值。按照式（3）計(jì)算羥自由基清除率。

1.3.5.3 總抗氧化能力測(cè)定

根據(jù)無(wú)花果中的多酚含量稀釋果汁，使其果汁中多酚含量分別 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，以同濃度的VC溶液為對(duì)照，測(cè)定不同多酚濃度下無(wú)花果汁的總抗氧化能力。

1.4 數(shù)據(jù)分析

各試驗(yàn)均做3次平行處理，結(jié)果取平均值。數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行誤差分析，Design-Expert 8.06軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 纖維素酶添加量對(duì)無(wú)花果出汁率及汁中多酚含量的影響

纖維素酶添加量對(duì)無(wú)花果出汁率及汁中多酚含量的影響見(jiàn)圖1。

圖1 纖維素酶添加量對(duì)無(wú)花果出汁率及汁多酚含量的影響Fig.1 Effect of cellulase amount on fig juice yield and polyphenol content in the juice

如圖1所示，纖維素酶添加量低于2.5%時(shí)，出汁率和多酚含量隨著纖維素酶添加量的增加而升高，在纖維素酶添加量為2.5%時(shí)，出汁率和多酚含量最高，分別達(dá)到74.33%和598.13 μg/mL；當(dāng)纖維素酶添加量超過(guò)2.5%時(shí)，出汁率和多酚含量隨著纖維素酶添加量的增加而緩慢下降。這是由于隨著纖維素酶濃度的提高，酶解效率提高，導(dǎo)致出汁率和汁中多酚含量升高；當(dāng)纖維素酶量達(dá)到最佳值時(shí)，則酶解反應(yīng)徹底，出汁率和多酚釋放量最高；當(dāng)纖維素酶的濃度超過(guò)最佳值，酶量過(guò)剩導(dǎo)致溶液體系粘度提高，反而限制了酶解反應(yīng)速率[13-15]，導(dǎo)致了出汁率和多酚溶出量的降低。因此，確定纖維素酶的適宜添加量為2.5%。

2.1.2 果膠酶添加量對(duì)無(wú)花果出汁率及汁中多酚含量的影響

果膠酶添加量對(duì)無(wú)花果出汁率及汁中多酚含量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 果膠酶添加量對(duì)無(wú)花果出汁率及汁多酚含量的影響Fig.2 Effect of pectinase amount on fig juice yield and polyphenol content in the juice

如圖2所示，當(dāng)果膠酶添加量低于0.6%時(shí)，出汁率和多酚含量隨著果膠酶添加量的增加而升高，且在果膠酶添加量為0.6%時(shí)，出汁率和多酚含量最高，分別達(dá)到71.44%和604.19 μg/mL，當(dāng)果膠酶添加量超過(guò)0.6%時(shí)，出汁率和多酚含量隨著果膠酶添加量的增加而緩慢下降。因此，確定的果膠酶添加量以0.6%為宜。

2.1.3 酶解溫度對(duì)無(wú)花果出汁率及汁中多酚含量的影響

酶解溫度對(duì)無(wú)花果出汁率及汁中多酚含量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 酶解溫度對(duì)無(wú)花果出汁率及汁多酚含量的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on fig juice yield and polyphenol content in the juice

如圖3所示，當(dāng)酶解溫度在35℃～50℃時(shí)，出汁率和多酚含量隨著溫度的升高而升高，且在50℃時(shí)，出汁率和多酚含量最高，分別達(dá)到73.88%和605.16 μg/mL；當(dāng)溫度超過(guò)50℃時(shí)，出汁率和多酚含量隨著溫度的升高而下降。這是由于生物酶的活性具有最適合的溫度，當(dāng)溫度超過(guò)最適溫度時(shí)，酶活性降低，會(huì)直接抑制酶解反應(yīng)速度，從而導(dǎo)致出汁率和多酚含量降低。因此，確定50℃為最佳酶解溫度。

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)無(wú)花果出汁率及汁中多酚含量的影響

酶解時(shí)間對(duì)無(wú)花果出汁率及汁中多酚含量的影響見(jiàn)圖4。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)無(wú)花果出汁率及汁多酚含量的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on fig juice yield and polyphenol content in the juice

如圖4所示，酶解時(shí)間小于90 min時(shí)，出汁率和多酚含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，且在90 min時(shí)，出汁率和多酚含量最高，分別達(dá)到73.12%和622.90 μg/mL；當(dāng)時(shí)間超過(guò)90 min時(shí)，出汁率和多酚含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。這是因?yàn)殡S著時(shí)間延長(zhǎng)，酶活力可以得到充分發(fā)揮，酶解反應(yīng)較完全，出汁率和多酚釋放量不斷升高，在最適宜的時(shí)間達(dá)到最高值；但是酶解時(shí)間越長(zhǎng)，水份蒸發(fā)及多酚氧化程度加大，會(huì)導(dǎo)致出汁率和多酚釋放量的降低。因此，確定90 min為適宜的酶解時(shí)間。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果與分析

2.2.1 回歸模型建立與顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-benhnken中心組合設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，以纖維素酶添加量、果膠酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間4個(gè)因素為響應(yīng)因子，出汁率和多酚含量為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素四水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of response surface tests

續(xù)表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Continue table 2 Results of response surface tests

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2中的響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)回歸擬合分析，建立二次多項(xiàng)回歸方程如下：

從方差分析表3和表4可以看出，2個(gè)模型方程極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明該模型所建立的回歸方程擬合度較好，試驗(yàn)選取的各因素與無(wú)花果出汁率與多酚含量之間的相關(guān)性很好[16]。其中A、B、C、AC、AD、BC、CD、A2、B2、C2、D2對(duì)無(wú)花果出汁率的影響極顯著，BD對(duì)無(wú)花果出汁率的影響顯著。4個(gè)因素影響無(wú)花果出汁率的主次因素為：酶解溫度＞纖維素酶添加量＞果膠酶添加量＞酶解時(shí)間。AD、BC、CD、A2、B2、C2、D2對(duì)無(wú)花果汁多酚含量的影響極顯著，B、C、D、AB對(duì)無(wú)花果汁多酚含量的影響顯著。由一次項(xiàng)的P值可知，影響無(wú)花果汁多酚含量的主次因素為：酶解溫度＞酶解時(shí)間＞果膠酶添加量＞纖維素酶添加量。

表3 出汁率回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of juice yield regression model

表4 多酚含量回歸模型方差分析Table 4 ANOVA of response surface model

2.2.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

響應(yīng)面分析圖是指在其他因素水平穩(wěn)定的條件下，響應(yīng)值與試驗(yàn)中2個(gè)因素所構(gòu)成的三維曲線(xiàn)面圖，可以直觀反映各因素之間的相互作用對(duì)響應(yīng)值的影響大小。響應(yīng)面曲面坡度較陡峭，表明因素變化對(duì)響應(yīng)值的影響顯著。以出汁率和多酚含量作為共同評(píng)價(jià)指標(biāo)，最佳交互項(xiàng)影響具體結(jié)果見(jiàn)圖5～圖7。

由圖5～圖7可以看出，纖維素酶添加量與酶解時(shí)間（AD），果膠酶添加量與酶解溫度（BC），酶解溫度與酶解時(shí)間（CD）坡面陡峭，對(duì)無(wú)花果出汁率及其多酚含量的交互影響作用均極顯著。

圖5 纖維素酶添加量與酶解時(shí)間對(duì)無(wú)花果出汁率及汁多酚含量影響的響應(yīng)面Fig.5 Response surface plots for the effects of cellulase amount and enzymolysis time on fig juice yield and polyphenol content in the juice

圖6 果膠酶添加量與酶解溫度對(duì)無(wú)花果出汁率及汁多酚含量影響的響應(yīng)面Fig.6 Response surface plot for the effects of pectinase amount and enzymolysis temperature on fig juice yield and polyphenol content in the juice

圖7 酶解溫度與酶解時(shí)間對(duì)無(wú)花果出汁率及汁多酚含量影響的響應(yīng)面Fig.7 Response surface plot for the effects of enzymolysis temperature and enzymolysis time on fig juice yield and polyphenol content in the juice

以出汁率為指標(biāo)，通過(guò)軟件分析，得出最優(yōu)酶解工藝參數(shù)為：纖維素酶添加量2.49%、果膠酶添加量0.57%、酶解溫度47.68℃、酶解時(shí)間92.60 min，預(yù)測(cè)理論無(wú)花果出汁率為77.763 5%；以多酚含量為指標(biāo)，得出最優(yōu)酶解工藝參數(shù)為：纖維素酶添加量2.47%、果膠酶添加量0.62%、酶解溫度50.85℃、酶解時(shí)間89.28 min，預(yù)測(cè)理論多酚含量為622.136 μg/mL。為操作方便，將上述工藝參數(shù)修正為纖維素酶添加量2.5%、果膠酶添加量0.6%、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間90 min，測(cè)得實(shí)際出汁率為75.13%，實(shí)際多酚含量為626.79 μg/mL，與預(yù)測(cè)值十分接近。該模型可靠，可以用來(lái)預(yù)測(cè)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中無(wú)花果汁的出汁率及其多酚含量。

2.3 無(wú)花果汁體外抗氧化性試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 不同多酚含量無(wú)花果汁的DPPH自由基清除率無(wú)花果汁多酚對(duì)DPPH·清除率見(jiàn)圖8。

圖8 無(wú)花果汁多酚對(duì)DPPH·清除率Fig.8 Scavenging rate of polyphenols in fig juice on DPPH·

由圖8得知，無(wú)花果汁中多酚濃度在0.1 mg/mL～0.5 mg/mL之間，果汁對(duì)DPPH自由基的清除率隨著多酚濃度的增加而提高；當(dāng)多酚濃度達(dá)0.6 mg/mL，果汁對(duì)DPPH自由基的清除率最高（90.26%）。表明無(wú)花果果汁具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，但其自由基清除率略低于同濃度下VC的自由基清除率。

2.3.2 不同多酚含量無(wú)花果汁的羥自由基清除率

無(wú)花果汁多酚抑制羥自由基活力見(jiàn)圖9。

圖9 無(wú)花果汁多酚抑制羥自由基活力Fig.9 Inhibition of hydroxyl radical activity by polyphenols in fig juice

由圖9得知，無(wú)花果汁中多酚濃度在0.1 mg/mL～0.4 mg/mL之間，果汁對(duì)羥自由基的抑制率隨著多酚濃度的增加而提高，當(dāng)無(wú)花果汁多酚濃度為0.6 mg/mL時(shí)，果汁的抗羥自由基活力高達(dá)250.96 U/mL；之后逐漸趨于平緩。表明一定濃度的無(wú)花果汁具有羥自由基抑制活力。但略低于同濃度下VC的羥自由基清除活力。

2.3.3 不同多酚含量無(wú)花果汁的總抗氧化能力

無(wú)花果汁多酚總抗氧化能力見(jiàn)圖10。

圖10 無(wú)花果汁多酚總抗氧化能力Fig.10 Total antioxidant capacity of polyphenols in fig juice

由圖10得知，在所設(shè)多酚濃度范圍內(nèi)，無(wú)花果汁的總抗氧化能力隨著濃度的增加而增強(qiáng)；當(dāng)濃度在0.5 mg/mL～0.6 mg/mL之間，總抗氧化能力趨于穩(wěn)定。多酚濃度為0.6 mg/mL無(wú)花果汁的總抗氧化能力最高，為84.35單位/mL。各多酚含量無(wú)花果汁的總抗氧化能力均低于同一濃度下VC溶液的抗氧化能力。

3 結(jié)論

本研究以無(wú)花果為原料，采用生物酶解法制備無(wú)花果汁，并通過(guò)單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面分析法優(yōu)化了最優(yōu)酶解制汁工藝，建立了可靠的數(shù)學(xué)模型，得到了無(wú)花果汁的最佳酶解制汁工藝參數(shù)為：纖維素酶添加量2.5%、果膠酶添加量0.6%、酶解溫度50℃、酶解時(shí)間90 min，在此條件下無(wú)花果的出汁率為75.13%，汁中多酚含量高達(dá)626.79 μg/mL。通過(guò)果汁的DPPH自由基清除能力、抗羥自由基活力、及其總抗氧化能力的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，酶解制備的無(wú)花果果汁具有較強(qiáng)的抗氧化活性，0.6 mg/mL多酚濃度的果汁，其DPPH自由基清除率、抗羥自由基活性、總抗氧化活力分別達(dá)90.26%、250.96 U/mL、84.35單位/mL。