赤霞珠葡萄皮渣酚類物質提取及抗氧化性研究

毛建利，李艷，2，*

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊050018；2.河北省發酵工程技術研究中心，河北石家莊050018）

我國2017年葡萄酒產量100.1萬噸，釀酒葡萄重量的70%可轉化為葡萄酒，其余為廢棄物，葡萄梗約5%～8%；葡萄皮和葡萄籽分別占果實部分的5%～7%和10%～15%[1-2]，由此可見，葡萄酒生產會產生大量廢棄物，如處理不當，會造成環境污染[3]。廢棄物葡萄籽、葡萄皮和葡萄梗中含有大量有益物質，梁傳紅，鄭亞蕾等[4-5]通過對葡萄籽成分及功能研究，證明其含有大量多酚類和脂肪酸類物質，包括兒茶酸等酚酸類，黃烷酮類、花色苷類[6]、黃酮醇類等物質及亞油酸等不飽和脂肪酸。多酚類物質有良好的體外抗氧化能力。陶姝穎等[7]的研究顯示葡萄皮渣中富含膳食纖維、多酚類和天然色素等植物營養成分，是優質的抗氧化膳食纖維資源。經葡萄酒發酵產生的葡萄皮渣中同樣存在著多種有益成分[8]，蘊含著巨大的經濟效益，其中含有花色苷[9]、白藜蘆醇、齊墩果酸等多種功能性成分，具有良好的體外抗氧化性能[10]。本研究針對我國大面積種植的釀酒葡萄赤霞珠，釀造干紅葡萄酒后的廢棄皮渣提取酚類物質，并研究提取液的抗氧化性，目的是提高產業的綜合加工能力和原料利用率，改善環境，實現變廢為寶，為民造福。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

2015年和2016年份，昌黎產區赤霞珠葡萄，采用傳統工藝釀造葡萄酒后收集皮渣，經55℃低溫烘干，分離葡萄皮和葡萄籽，分別磨粉，過40目篩，備用。

過硫酸鉀、抗壞血酸、冰乙酸、無水碳酸鈉、乙酸鈉（均為分析純）：天津市永大化學試劑有限公司；DPPH、ABTS標品（均為分析純）：上海寶曼生物科技有限公司；鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉、硫酸鋰（均為分析純）：天津市博迪化工有限公司；磷酸二氫鈉分析純：天津市百世化工有限公司；95%乙醇分析純：石家莊市新宇三陽實業有限公司；三氯乙酸、沒食子酸（均為分析純）：天津市大茂化學試劑廠；氯化鐵、水楊酸（均為分析純）：天津市標準科技有限公司；硫酸亞鐵（分析純）：天津市四通化工廠；30%過氧化氫：天津政成化學制品有限公司；濃鹽酸：昆山金城試劑有限公司；氯化鉀（分析純）：天津市晶科化工有限公司；乙酸（分析純）：天津市東麗區天大化學試劑廠；無酸鈉（分析純）：天津市津東天正精細化學試劑廠；鉬酸鈉（分析純）：天津市化學試劑西廠；濃硫酸：珠海市華成達化工有限公司。

1.2 儀器與設備

HH-4數顯恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器有限公司；AR1140分析天平：深圳市時代之峰科技有限公司；DELTA 320pH數字酸度計：梅普勒-托利多儀器有限公司；JJ1000電子天平：常熟市雙杰測試儀器廠；SHZ-HI真空泵：上海知信實驗儀器技術有限公司；電子萬用爐、101-0AB電熱鼓風干燥箱、SX-2.5-10馬弗爐：天津市泰斯特儀器有限公司；SP-756紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酚類物質成分測定

花色苷：pH值示差法[11]。稱取1.50g樣品溶于20mL 0.5%HCl酸化的60%乙醇溶液，50℃水浴3 h，離心去上清液。再加入15 mL酸化乙醇，50℃水浴3 h離心去上清液，重復3次，合并3次上清液定容至50 mL測定花色苷含量，求出1.50 g樣品中花色苷的質量分數即為樣品中花色苷的提取得率。

單寧（以單寧酸計）：福林-丹尼斯法[12]。稱取10.00 g樣品，于250 mL容量瓶中，加水50 mL放入60℃烘箱中過夜。次日將清液濾至250 mL容量瓶中，殘渣加入30 mL熱水，80℃水浴20 min。清液濾入容量瓶，再加30 mL熱水，80℃水浴20 min重復3到4次直至提取液與10 g/L FeCl3溶液不生成藍色產物為止。稀釋至刻度，離心測定樣品提取液對應的單寧吸光度，計算單寧含量，求出10.00 g樣品中單寧的質量分數即為樣品中單寧的提取得率。

總酚（以沒食子酸計）：福林-肖卡法[13]。稱取1 g樣品，按料液比 1∶10（g/mL）加入 50%乙醇溶解，60 ℃，水浴1 h，冷卻過濾后取3 mL定容至25 mL，測定樣品提取液對應的總酚的吸光度，計算總酚含量，求出1.00 g樣品中總酚的質量分數即為樣品中總酚的提取得率。

1.3.2 葡萄皮和葡萄籽中酚類物質提取

1.3.2.1 單因素試驗

分別以提取溫度、提取時間、乙醇濃度和料液比為變化因素，以總酚提取率為評價指標進行單因素試驗。溫度（℃）設定為：30、40、50、60、70，固定條件為料液比 1 ∶10（g/mL）、60%乙醇提取 60 min；提取時間（min）設定為：20、40、60、80、100，固定料液比 1 ∶10（g/mL）、60%乙醇、提取溫度60℃；乙醇濃度設定為：30%、40%、50%、60%、70%，固定料液比 1∶10（g/mL）、溫度60 ℃提取 60 min；料液比（g/mL）變量值為：1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，固定 50%乙醇，60 ℃提取 60 min。

1.3.2.2 正交試驗優化酚類物質提取條件

在單因素試驗基礎上，采用L9（34）正交試驗優化酚類物質提取的條件，因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Orthogonal experimental factor level table

1.3.3 葡萄皮渣中酚類提取物的體外抗氧化性能測定

1.3.3.1 ABTS+自由基清除能力測定

樣品ABTS+自由基的清除能力采用分光光度法[14]：

式中：A0為不加樣品時的吸光度；A為加入不同量樣品時的吸光度。

取1 mL提取液，用提取溶劑稀釋成VC同等濃度。

VC用去離子水稀釋成終濃度（μg/mL）為 80、90、100、110、120、140、160 的溶液。

取4 mL ABTS工作液，加入100 μL待測液，充分混勻，黑暗環境下反應6 min后于734nm測定吸光值。

1.3.3.2 DPPH自由基清除能力的測定

DPPH的測定方法采用分光光度法[15]：

式中：A空白為不加樣品時的吸光度；A樣品為加入不同量樣品時的吸光度。

VC用去離子水稀釋成終濃度（μg/mL）為：10、20、30、40、50、60、70 的溶液。

分別吸取2mL樣品和VC溶液于試管中，加入2mL DPPH溶液，使總體積為4 mL，每個樣品做3個平行對照，搖勻后避光，室溫放置30 min，517 nm測定吸光值，記為A樣品。用2 mL提取溶劑代替樣品溶液，吸光值記為A空白。

1.3.3.3 羥自由基清除能力的測定羥自由基清除能力的測定采用分光光度法[16]：

式中：A1為加入樣品和羥基母體溶液時的吸光度；A2為不加羥基母體溶液時的吸光度；A0為只加羥基母體溶液時的吸光度。

取1 mL提取液，用去離子水稀釋成VC同等濃度作為待測液。

VC用去離子水稀釋成終濃度（μg/mL）為：50、100、150、200、250、300 的溶液。

取3 mL羥基母體溶液，分別加入1 mL不同濃度的待測液，充分混勻，37℃恒溫水浴15 min，530 nm測定各組的吸光值A1（分光光度計用去離子水校零），將羥基母體溶液用等同的提取溶劑代替，其他操作相同記為A2，將樣品溶液用等同的提取溶劑代替其它操作相同記為A0。

1.3.3.4 鐵離子還原力測定

鐵離子還原能力的測定采用分光光度法[17]：

式中：A0我加入樣品和試劑時的吸光度；A1為不加樣品時的吸光度。取1 mL提取液，用提取溶劑稀釋成VC同等濃度。VC用去離子水稀釋成終濃度（μg/mL）為：10、20、30、40、50、60、80、120、140 的溶液。

吸取2.5 mL磷酸鹽緩沖溶液、2.5 mL鐵氰化鉀溶液、及不同濃度的2.5 mL樣品溶液，充分混勻。50℃水浴20 min后快速冷卻，加2.5 mL10%三氯乙酸混勻，3 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加2.5 mL 0.1%FeCl3溶液，反應10 min，在700 nm測定吸光值（A0），將樣品用同等體積的提取溶劑替代，其他方法相同，測定吸光度A1。

1.3.4 數據處理

本研究通過 Excel 2003，Origin8.5，SPSS17.0 進行試驗數據的匯總與統計分析。

2 結果與分析

2.1 葡萄皮與葡萄籽中酚類物質提取和測定結果

赤霞珠葡萄酒廢棄皮渣經預處理得到的粉狀物，在相同提取條件下，料液比1∶10（g/mL）、50%乙醇、60℃、水浴提取60 min，以酚類物質提取率為評價指標，測定結果見圖1。

圖1 樣品的酚類物質的提取結果Fig.1 Results of phenolic extraction of samples

圖1可見，葡萄籽中總酚和單寧提取率均高于葡萄皮，分別達到6.82%和0.79%。說明赤霞珠葡萄籽具有潛在提取酚類物質的價值，作為后續正交試驗優化提取酚類物質，及抗氧化性能測定選定的樣品。由圖1還可看到葡萄皮和葡萄籽中花色苷類物質提取率較低，分別為0.10%和0.099%，也有一定的提取價值[18]。說明釀酒過程中對花色苷浸提效果明顯，絕大多數花色苷類物質進入葡萄酒中，釀酒工藝條件合適。

2.2 葡萄籽中酚類物質提取單因素實驗

分別進行提取溫度、提取時間、乙醇濃度和料液比對酚類物質提取率的影響進行單因素試驗，結果見圖2。

圖2 赤霞珠葡萄籽中總酚提取條件的單因素試驗Fig.2 Single factor experiment of total phenol extraction conditions from Cabernet Sauvignon grape seed

由圖2可知，分別在提取溫度60℃，提取時間60 min，乙醇濃度 60%，料液比 1∶10（g/mL）時，酚類物質提取率達到最高值，并出現拐點。眾所周知，在浸取過程中，溫度影響分子運動的速率，隨著溫度升高，固體中可溶性物質分子運動加劇，酚類物質滲出、溶解和擴散至溶液中[19]，60℃時總酚提取率最高為6.88%，到70℃時降低，溫度過高會破壞酚類物質[20]或加速酚類物質的氧化分解。在恒定溫度下，提取時間延長會促使物質溶出，因此呈現上升趨勢，達到高峰值后下降[21]，提取60 min時，總酚提取率最高達8.96%，時間再長導致提取液中總酚成分在較高溫度下被破壞。乙醇可以改變物質的溶解性，酸化乙醇更利于酚類物質和單寧的溶出，葡萄籽中酚類物質有些是醇溶性的，因此隨著乙醇濃度的提高，酚類物質提取總量也會提高，在乙醇濃度達60%，總酚提取率最高達8.99%。料液比是指溶液的固液比例，液體量增加溶液變稀，固體物質的傳質阻力變小，傳質推動力提高，但整體提取率下降，從工程學角度說不合算。減少溶劑用量可降低能耗、提高提取效率。從圖2看，在料液比1∶10（g/mL）附近，總酚提取率最高，達8.51%。

2.3 正交試驗優化赤霞珠葡萄籽中酚類物質提取條件

在單因素試驗基礎上進行正交試驗優化赤霞珠葡萄籽中酚類物質提取條件，結果見表2，正交試驗方差分析結果見表3。

表2 正交試驗優化葡萄籽中酚類物質提取條件Table 2 Orthogonal experiments to optimize the extraction conditions of phenols from grape seeds

由表3可知，各因素的極差大小順序為C＞A＞B＞D，由此可得出，影響赤霞珠葡萄籽中酚類物質提取率的4個因素先后順序為：料液比＞提取時間＞提取溫度＞乙醇濃度，最優的提取工藝條件為：A2、B3、C3、D2，即提取溫度70℃，乙醇濃度為60%，料液比為1 ∶15（g/mL），提取時間 60 min。由表 3 可知，提取時間、提取溫度、料液比、乙醇濃度，對總酚提取率的影響極顯著。為了考察最優條件的再現性，進行了驗證試驗。在正交試驗最優條件下，進行驗證和擬合試驗，試驗平行3次求得平均值，總酚的平均提取率10.21%。比正交表中最佳提取率提高0.88%。

表3 正交試驗方差分析結果Table 3 Orthogonal test variance analysis results

2.4 酚類物質提取物體外抗氧化性研究

2.4.1 酚類提取物對ABTS+自由基的清除性能

以VC為陽性對照，研究赤霞珠葡萄籽酚類提取液對ABTS+自由基的清除率，以VC和提取液濃度為橫坐標，ABTS+自由基清除率為縱坐標作圖，對比效果見圖3。ABTS/ABTS+的氧化還原電位為0.68 V，容易發生電子轉移，生成穩定的綠色自由基ABTS+[23]。ABTS溶液在過硫酸鉀的催化下發生電子轉移，生成穩定呈現綠色的ABTS+自由基。赤霞珠葡萄籽提取物具有還原性，將ABTS+自由基還原并發生褪色反應，褪色的程度與ABTS+自由基得到的電子數目呈現良好的相關性，因此通過溶液吸光值的改變就可了解其抗氧化性強弱。

圖3 赤霞珠葡萄籽酚類提取物對ABTS+自由基的清除性能Fig.3 The scavenging performance of ABTS+free radicals by phenolic extracts of Cabernet Sauvignon grape seed

由圖3可見，赤霞珠葡萄籽總酚提取液比VC清除ABTS+自由基的能力強，且隨著總酚提取液濃度增加，清除率提高，當赤霞珠葡萄籽總酚提取液加入量到100 μg/mL以上時，對ABTS+自由基的清除率能達到100%，由試驗結果分析可知，赤霞珠葡萄籽總酚提取物對ABTS+自由基的清除效果明顯。

2.4.2 酚類物質提取物對DPPH自由基的清除性能

DPPH自由基有單電子，在517 nm有強吸收，其醇溶液呈紫色的特性。當有自由基清除劑存在時，因與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，褪色程度與其接受的電子數成定量關系，因而可用分光光度計進行快速定量分析，抗壞血酸等具有遞電子和遞質子能力的抗氧化劑對DPPH自由基的清除作用是通過抗氧化劑把電子和質子傳遞給DPPH自由基，從而生成穩定的分子態DPPH2的結果[25]。以VC和提取液濃度為橫坐標，DPPH自由基清除率為縱坐標作圖，對比效果見圖4。

圖4 赤霞珠葡萄籽酚類提取物對DPPH自由基的清除性能Fig.4 DPPH free radical scavenging performance of phenolic extracts of Cabernet Sauvignon grape seed

赤霞珠籽總酚提取液的加入量在20 μg/mL時，對DPPH自由基的清除率達到95.00%，隨提取液量濃度增加，清除率增加，當提取液的加入量達到30 μg/mL時對DPPH自由基的清除率達到100%。VC溶液對DPPH自由基的清除力明顯低于葡萄籽總酚提取液對DPPH的清除能力。

2.4.3 酚類物質提取物對羥自由基的清除性能

羥自由基（·OH）系活性氧的一種，它可以通過發生電子轉移，參與奪氫及羥基化等反應與生物體內多種分子作用，引起機體損傷，酚類物質和VC可作為還原劑或自由基清除劑能提供一個氫原子與羥自由基結合形成穩定結構[26]，從而改變整個反應體系的吸光度，由此計算樣品對羥自由基的清除性能。以VC和提取液濃度為橫坐標，羥自由基清除率為縱坐標作圖，對比效果見圖5。

圖5 赤霞珠葡萄籽酚類提取物對羥自由基的清除性能Fig.5 The scavenging properties of hydroxyl free radicals of phenolic extracts of Cabernet Sauvignon grape seed

由圖5可知，提取液對羥自由基的清除能力略高于VC。如VC濃度0.25 mg/mL時，對羥自由基的清除率為54.44%，而同等濃度的赤霞珠籽總酚提取液對羥自由基的清除率為65.12%。隨濃度增加對羥自由基的清除率都明顯上升。

2.4.4 赤霞珠葡萄籽中酚類物質提取物對鐵還原力的測定

還原力法的原理為：K3Fe（CN）6+樣品→K4Fe（CN）6+樣品氧化物 K4Fe（CN）6+Fe3+→Fe4[Fe（CN）6]3

在700 nm測定吸光度A，A越大，則樣品的還原力越大。以VC和提取液濃度為橫坐標，鐵離子的清除率為縱坐標作圖，對比效果見圖6。

圖6 赤霞珠葡萄籽酚類提取物對鐵還原力的測定Fig.6 Determination of iron reducing power of phenolic extracts from Cabernet Sauvignon grape seed

鐵還原力的測定試驗中，赤霞珠籽總酚提取液加入量在20 μg/mL時對鐵離子的清除率達到77.5%，隨提取液濃度增加，清除率升高。相同濃度的VC溶液對鐵離子的清除率能達到71.82%。由此可知，赤霞珠籽總酚提取液對鐵離子的還原力大于VC。

3 結論

由試驗結果可知，影響赤霞珠葡萄籽中酚類物質提取率的4個因素先后順序為：料液比＞提取時間＞提取溫度＞乙醇濃度，最優的提取工藝條件為：提取溫度70℃，乙醇濃度為 60%，料液比為 1∶15（g/mL），提取時間60 min。在最優提取條件下得到的總酚的提取率為10.21%。

以VC為參照測定提取液對ABTS+自由基、DPPH自由基、羥自由基清除力和鐵離子還原力。結果顯示提取液對自由基清除能力及鐵離子的還原能力均高于VC溶液，對DPPH自由基的清除效果最好，濃度為20 μg/mL的提取液對DPPH自由的清除率可達95%。說明酚類提取液體外抗氧化能力較強。

赤霞珠葡萄釀酒后廢棄的皮渣含有豐富的可利用資源，具有提取酚類物質，并開發抗氧化保健產品的潛在效益。