雞傳染性支氣管炎病毒的分離鑒定

金福源 陶艷華 李成貴 彭會建

（江蘇省蘇州市吳江區動物衛生監督所 215200）

雞傳染性支氣管炎是由傳染性支氣管炎病毒引起的，通過臨床癥狀進行初步判斷，再根據其流行性和病理變化等初步診斷，確診還需要利用實驗室技術進行檢測。許多試驗通過一些生物學的實驗技術，RT-PCR、血清學試驗、核苷酸測序等進行分離鑒定病毒。傳統的病毒分離與鑒定方法對IBV 進行診斷會更加準確，并且許多研究利用分離得到的病毒株可以研發出新型的疫苗和診斷試劑盒，為未來的預防和治療奠定基礎。

1 材料

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

SPF 雞胚（山東濟南斯帕法斯家禽有限公司）。

1.1.2 試驗病料

取腎、肺、氣管等組織器官，或者急性期病雞氣管滲出物，制成懸浮液。（每毫升加青霉素和鏈霉素各1 萬IU，置4℃冰箱過夜，以抑制細菌污染）。

1.1.3 試驗儀器和試劑

儀器：電泳儀；紫外燈儀；基因擴增儀；單人凈化操作臺；37℃恒溫箱；臺式離心機；孵化機。

生化試劑Trizol Reagent；RNA PCR Kit、Mix、D2000 DNA Marker、膠回收試劑盒均；瓊脂糖。胰蛋白酶 （濃度為1.47%）；雞紅細胞（濃度為0.8%）；青霉素和鏈霉素（濃度為940IU）；動物疫病基因芯片診斷試劑盒。

2 試驗方法

2.1 動物接種試驗

將采集到的病料加入滅菌生理鹽水中進行細細研磨，放入離心機中12000r/min 離心20min；之后再將上層清液用濾過膜過濾除菌，接種20 枚9 日齡SPF 雞胚，在尿囊腔中注入0.1ml/胚。觀察雞胚死亡情況，舍去一日內死亡的雞胚，對1～6d 內死雞胚進行打蛋觀察雞胚的病變[1]。無菌條件下收集1～6d 內死雞胚的尿囊液，接種10 日齡SPF 雞胚20 枚，連續傳3 代，再傳至10 代進行備用。分離第3 代毒尿囊液，用肌肉注射的方式接種20 只SPF 雞，0.1ml/只，觀察SPF 雞的發病率和死亡率，對死亡雞進行剖檢并觀察病理變化。

2.2 毒價測定

第3 代分離毒尿囊液用經滅菌后的生理鹽水依次作10 倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6、10-7，4 個稀釋度分別接10～11 日齡SPF 雞胚10 枚，0.1ml/胚，孵育至144h。24h 以內死亡的雞胚舍去，根據接種后24～144h 內雞胚死亡的數量及144h 活胚中有特異性病理變化的雞胚總數計算毒價。

2.3 HA 試驗

IBV 在雞胚中可干擾NDV-B1 株血凝素的產生[2]。取9～11日齡雞胚20 枚，分兩組，一組先尿囊液進行接種被檢IBV 雞胚液；另一組作為對照。10～18h 后兩組同時進行尿囊內接種NDV-B1，孵化36～48h 后，置雞胚與4℃8h，取雞胚液做HA。

間接HA 試驗陽性樣品用兔抗雞IBV 陽性血清測定血凝抑制（HI）效價。

2.4 RT-PCR 檢測

2.4.1 RNA 提取

（1）取被測樣品100μl，加300μlTirzol 裂解液，上下顛倒混勻，冰上靜置15min[2]；（2）加入氯仿后充分混勻，放在冰上靜置10min，然后4℃、12000r/min 離心20min；（3）取上清液250μl，加入250μl 異丙醇，充分混勻，置于冰上15min，然后4℃、12000r/min 離心20min；（4）舍去上清液，加入75%的乙醇1ml，然后4℃，12000r/min 離心10min，舍去上清液，放置5min；（5）加入15μlddH2O 除去沉淀，此時得到產物就是RNA 溶解液。

2.4.2 RT-PCR 擴增體系

PCR 擴增體系，見表1。

表1 PCR 擴增體系

2.5 序列比對

將測序獲得的核苷酸序列與核苷酸序列數據庫進行比對分析[3]。

3 試驗結果

3.1 動物接種試驗結果

初代接種的雞胚，孵化至19d，可使少量雞胚發育受阻，有個別死亡的情況，而多數的雞胚能存活。雞胚連續傳至三代后，雞胚便出現規律性死亡現象，剖檢死雞胚可見雞胚蜷縮、矮小，出現“侏儒胚”的典型癥狀。臨床病料樣品接種第10代的9～11 日齡SPF 雞胚，接種后1～2d 內雞胚全部死亡。收集死亡雞胚尿囊液作為分離毒株。

3.2 毒價測定結果

設置10-4、10-5、10-6、10-74 個稀釋梯度組，觀察雞胚死亡情況及特異性病痕的雞胚數量。如表2 所示，根據Reedmuench 法計算，得出該分離病毒的毒價為10-4.8/0.1ml。

表2 毒力測定結果

3.3 HA 試驗結果

試驗組雞胚液有49%以上HA 滴度在1:20 以下，對照組91%以上雞胚液HA 滴度在1:40 以上[2]。

分離出來的毒株進行血凝試驗，其中1%的雞紅細胞不出現凝集。病料的上清液接種雞胚，觀察雞胚存活情況是全部能存活。通過胰酶處理之后，血凝能夠被IBV 陽性血清抑制，HI效價在1：24～1：28；第一代的尿囊液進行直接HA、間接HA試驗，得到的結果均為陰性，并且胚體均發育正常，第二代到第十代第的尿囊液進行直接HA 試驗，試驗的結果均為陰性，間接HA 試驗的結果均為陽性。該病毒在雞胚上傳至第三代時，死雞胚或侏儒胚，隨傳代次數的增加萎縮癥狀呈現地越來越明顯。雞胚接種生理鹽水后，尿囊液都沒有出現紅細胞凝集的現象，對照組雞胚的尿囊液平均HA 效價在1：28.3 之上，試驗組的平均HA 效價在:1:24.6 之下，說明分離毒株干擾NDV 的增值。接種分離毒株的數量越多，干擾率會越高。從而初步判斷該尿囊液中分離物中有IBV。

3.4 RT-PCR 檢測結果

通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR 擴增產物，可觀察到在427bp 處有特異的擴增條帶，根據相關的報道分析可知[4]，表明分離毒為IBV，參見附圖。

3.5 分離毒株的序列分析結果

通過核苷酸序列的對比 [5]可以得到毒株基因的核苷酸序列與國內廣泛使用的歐洲呼吸型疫苗株H52、H120 的各自的同源性可達到78.5%和78.7%；與美國呼吸型、腎型代表毒株M41、Holte 的同源性分別是78.9%和79.1%；與澳大利亞呼吸型株T 的同源性是78.3%；與國內呼吸型疫苗株W93 的同源性為78.5%；與變異株5/91 的同源性為98.7%；同腺胃型毒株CK/CH/LDL/97I 的同源性是75.5%；與臺灣地區的分離病毒株TW97-4 的同源性是78.5%。HP-W 株S1 基因編碼氨基酸的序列與變異株5/91 的同源性達97.2%，同其他毒株氨基酸序列的同源性都在79%之下。通過軟件分析可得該分離病毒株與現有的腎型、呼吸型疫苗株的親緣性都比較遠，與變異株5/91 有很近的親緣性。

附圖 RT-PCR 結果

4 討論

雞傳染性支氣管炎的確定需要先通過臨床癥狀進行初步判斷，再根據其流行性和病理變化等初步診斷，確診還需要利用實驗室技術進行檢測。本次試驗通過一些生物學的實驗技術，RT-PCR、血清學試驗 [5]等進行分離鑒定病毒，最后確定該養殖場雞群發病病因是IBV。傳統的病毒分離與鑒定方法對IBV進行診斷會更加準確，并且利用分離得到的病毒株可以研發出新型的疫苗和診斷試劑盒，為未來的預防和治療奠定基礎。由于IBV 血清型比較多且病毒變異速度較快，使用疫苗前要對當地流行的IBV 血清型進行調查，這樣得到的診斷和之后的防治才能更準。

各種年齡的雞群都易感IBV，雞舍由于飼養管理不當、養殖密度大、通風不佳、飼料營養不均衡等原因都會發生IBV 的感染。現在IB 還沒有特效藥品，所以對其病的防控措施方法是加強飼養管理和疫苗接種。阻止應激反應，保證飼養環境和飼料的衛生。預防該病的免疫程序一般為7～10 日齡弱毒疫苗首免，30 日齡弱毒疫苗二免，肌肉注0.4ml/只，并且要根據當地該疫病流行情況選用合適的疫苗毒株。外來的雞群應先隔離觀察一段時間，無癥狀的情況下再混入雞舍飼養。