ICR小鼠體內染色體畸變試驗的優化*

霍桂桃 胡燕平 楊 瑩 趙婷婷 宋 捷 汪 祺 文海若

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

外源物質或其代謝產物與體內DNA作用后可能產生損傷，其中不可修復的損傷隨DNA復制最終可誘導癌癥。發生于體細胞的染色體畸變是癌癥發生的重要分子基礎。染色體畸變試驗(Chromosome Aberration Test,CAT)是一項以形態學觀察為主的檢測受試物對細胞染色體結構及數量潛在影響的經典遺傳毒性評價方法，該方法的主要觀察內容包括結構畸變(即染色體斷裂、易位、交換等)和數目畸變(非整倍體或多倍體的形成)[1-2]。與觀察突變或染色體損傷結果的小鼠淋巴瘤細胞試驗和微核試驗不同，染色體畸變試驗可以直接對染色體損傷的具體形式和程度進行觀察，在遺傳毒理學研究中具有不可替代的作用。體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗是藥物、化妝品和醫療器械產品遺傳毒性評價中的常規試驗方法，而在新資源食品、食品添加劑和保健食品評價中通常開展嚙齒類動物骨髓細胞染色體畸變試驗。此外，體內染色體畸變試驗也是體內微核結果為陽性或可疑陽性的受試物的后續試驗方法，并且在新藥評價中也會涉及[3]。

染色體畸變試驗的標本制備和閱片工作較為繁瑣，而且需要一定的經驗。能否通過適宜的試驗條件在捕捉染色體損傷峰值出現的同時保證良好的中期分裂相制片效果是獲得客觀評價結果的基石。如秋水仙素(Colchicine,COL)造模、低滲處理、高空滴片等過程，均會對中期分裂相的分散程度及制片效果產生影響[4-5]。在監管領域中，用于藥物或保健食品的體內染色體畸變試驗分析的中期分裂相細胞通常為骨髓中的有核細胞，且淋巴細胞占大多數。因淋巴細胞較體外試驗所用的中國倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)、中國倉鼠肺細胞(China Hamster Lung，CHL)等細胞小，且每個細胞所需觀察的染色體條數多(小鼠淋巴細胞正常染色體數目約36～46條，CHL細胞正常染色體數目范圍是23～27條)，對體內染色體畸變試驗的制片要求更高。OECD指導原則[6]建議嚙齒類動物體內染色體畸變試驗如為單次給藥，應分別在給藥后12～18 h和給藥后24 h以后分別取材；如為多次重復給藥，則可在末次給藥后12～18 h取材。指導原則建議在小鼠取材前3～5 h 給與秋水仙素，也有文獻報道秋水仙素的給藥時間可在取材前2 h。可見指導原則僅對給藥方式和取材時間提出框架范圍，未作嚴格規定。而文獻報道所用的試驗條件各不相同。用于申報的試驗數據，通常需來自標準化的試驗流程，從而保證數據的有效性。故有必要比較不同的給藥、取材方式對制片及觀察結果的影響，從而對試驗條件進行優化，使研究數據更好地為“三品一械”的監管服務。這也是本研究的重要意義所在。

雖然根據經濟合作與發展組織(Organisation for Economic Co-operation and Development，OECD)頒布的指導原則[7]和食品安全國家標準[8]，無論大鼠或小鼠均可用于體內染色體畸變試驗，但實際應用中多用小鼠。對于微核試驗出現可疑陽性的藥物來說，為與微核試驗結果作有效對比，需使用ICR小鼠股骨骨髓細胞開展。因此本研究選擇微核試驗常用種屬，即ICR小鼠開展骨髓染色體畸變試驗，分別在不同時間點給予染色體斷裂劑CP 及中期分裂相造模試劑COL，比較不同給藥和取材時間點，以及不同給藥濃度對小鼠骨髓細胞染色體畸變發生率的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1試劑：溶媒0.9%氯化鈉注射液(sodium chloride injection，NaCl)購自石家莊四藥有限公司；陽性試劑CP(批號：91K1176，純度≥純度1)購自Sigma Aldrich，給藥當日現用現配，配制濃度為4 mg/mL；胎牛血清(fetal calf serum,FBS)購自GIBCO公司；COL(批號：401181/151200,純度≥度11)購自 Fluka公司；氯化鉀(potassium chloride，KCl)購自Sigma Aldrich，使用去離子水配制為0.075 mol/L。Giemsa 染料購自Sigma Aldrich，臨染色前1份Giemsa原液經9份1/15 mol/L磷酸鹽緩沖液(1/15 mol/L Na2HPO4溶液和1/15 mol/L KH2PO4溶液1∶1混合，pH6.8)稀釋配制為10% Giemsa應用液。

1.1.2實驗動物：SPF級ICR(CD-1)小鼠36只，給藥時7～8周齡(購入時6～7周齡，體質量30～32 g，檢疫期7 d)，均為雄性，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號為SCXK(京)2016-0011。動物在恒溫(20～26)℃、恒濕(40%～70%)、各12小時明暗周期的條件下飼養，飼養密度為2～3只/籠。給予鼠全價顆粒飼料喂養，自由攝食及飲水。研究方案通過國家藥物安全評價監測中心實驗動物福利倫理委員會的倫理審查。

1.1.3儀器：NTS-1300 恒溫振蕩水槽，東京理化器械株式會社；CX-41光學顯微鏡，奧林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1動物分組及給藥：36只小鼠購入后在檢疫期第7天，根據體質量使用TOXSTAT2006數據統計分析軟件隨機分組，分組時個體體質量差異不得大于平均體質量的±20%。全部動物首先分為給藥后18 h取材組和給藥后24 h取材組，每組下設COL 4 mg/kg組(取材前4 h給予)和COL 10 mg/kg組(取材前2 h給予)給藥組。不同COL濃度組以下，再分別設0.9% 氯化鈉注射液溶媒對照組、CP 10 mg/kg組和CP 40 mg/kg組，每組3只。COL及CP取材時間及使用劑量根據指導原則及文獻報道確定[3,9]。給藥方式均為腹腔注射，給藥體積均為10 mL/kg。試驗設計詳見表1。

1.2.2臨床癥狀觀察及體質量測定：給藥期間每天上午和下午對所有動物進行隔籠觀察，包括是否死亡、瀕死、活動狀況、外觀及被毛、有無外傷、糞便情況等；給藥前、給藥期間及解剖前對動物進行稱重。

1.2.3取材及標本制作：在動物解剖取材日，采用CO2吸入法麻醉處死動物，然后摘取雙側股骨制作骨髓標本。用胎牛血清將股骨中骨髓沖下制備骨髓細胞懸液；將骨髓懸液經1 000 r/min離心5 min，棄去大部分上清液，留適量上清將骨髓細胞沉淀充分吹打均勻；每個樣本中加入7 mL 37 ℃預熱的0.075 mol/L KCl溶液,輕輕混勻細胞后，將樣本置于37 ℃條件下低滲處理約40～60 min。低滲處理后，加入固定液(甲醇∶冰醋酸比例約3∶1)3 mL預固定樣本，以1 000 r/min離心10 min，棄上清;加入3 mL固定液，固定20 min后以1 000 r/min離心5 min，棄上清；用吸管將細胞團塊打碎，加入5 mL固定液，37 ℃水浴固定20 min后以1 000 r/min離心5 min，棄上清。加入0.5 mL固定液，將沉淀物吹打混勻。滴片(30 cm左右高度滴4～5滴在預冷的玻片上，細胞自然分散)制備標本(3～5張/只)，室溫自然風干。

表1 分組及試驗設計Table 1 Grouping and test design

10%Giemsa(1份Giemsa原液與9份pH6.8磷酸緩沖液混合)染色30 min后，以蒸餾水或自來水沖洗玻片。染色后的玻片存放于標本盒中待鏡檢觀察。

1.2.4取材及標本制作:取染色玻片標本，在顯微鏡下(放大倍數為400～1 000倍)進行觀察。每只動物至少分析100個中期分裂相細胞。記錄每個細胞的染色體結構畸變的畸變類型，包括染色單體裂隙(ctg)、染色體單體斷裂(ctb)、染色單體交換(cte)、染色體裂隙(csg)、染色體斷裂(csb)、染色體交換(cse)、碎片化(frg，可見10個以上斷片)，及是否為多倍體(pol)。根據以上結果計算出各組平均結構畸變細胞率(不含ctg及csg，AC%)、結構畸變細胞率(含ctg及csg，ACG%)、多畸變細胞率(不含ctg及csg，MAC%)及多倍體細胞率(PC%)。正常骨髓有核細胞及存在結構畸變和數目畸變的骨髓有核細胞中期相染色體圖例如圖1所示。

圖1 正常及異常ICR小鼠骨髓細胞染色體注：ICR小鼠骨髓染色體標本經Giemsa染色后，在油鏡(×1000)下觀察到的正常染色體(A)、結構異常(B-C，包括裂隙及斷裂)及多倍體(D)結構示意。Fig.1 Normal and aberrated chromosome in ICR mouse bone marrow cellsNote：The normal chromosome (A),structural abnormalities (B-C,including gaps and breakage)and polyploid (D)observed in the ICR mouse bone marrow chromosome specimens after the Giemsa staining under an oil immersion lens(×1000).

1.3 統計方法

2 結果

2.1 整體毒性評價

給藥后試驗動物的臨床癥狀觀察和體質量變化是衡量受試物對動物毒性程度的重要指標。實驗期間各組動物未見與給藥相關的異常臨床癥狀或死亡。各組動物的體質量在各個時間點與同期本組對照組動物相比未見差異(P>0.05，表2)，提示本研究所選用的CP及COL濃度對動物整體無明顯直接毒性作用，給藥方式可行。

表2 各組動物體質量測定結果Table 2 Body weight measurement results of each group

注：單因素方差分析
Notes:one-way ANOVA

2.2 染色體畸變分析結果

2.2.1不同給藥濃度及取材時間點染色體畸變類型的關系

與各小組內的溶媒對照組相比(表3及圖2)CP18 h-COL4h組、CP18 h-COL2h組、CP24 h-COL4h組、CP24 h-COL2h組的AC%、AGC%和MAC%均顯著性升高(P<0.01)；每小組內CP高劑量組AC%顯著性高于CP低劑量組(P<0.01)，CP劑量較高時產生的染色體畸變更為嚴重，與陽性劑CP的預期結果相符。試驗期間低劑量給藥2次，高劑量給藥1次，因此上述結果也提示 CP所致染色體畸變與給藥次數關系較小，與單次給藥濃度和給藥時間點關系較大。從COL使用劑量及取材時間角度分析，CP18 h-COL4h組的AC%、ACG%和MAC%均低于CP18 h-COL2h組，并存在顯著性差異(P<0.05)，提示使用高劑量的COL(10 mg/kg)盡管作用時間縮短，亦可產生額外的染色體損傷。

圖2 不同給藥濃度及取材時間點與染色體畸變類型分布的關系注：不同給藥取材方式對各組平均AC%(不含ctg及csg,A)、ACG%(含ctg及csg，B)、MAC%(不含ctg及csg，C)及PC%(D)的影響。卡方檢驗，與同給藥取材時間點溶媒對照組比較。*P<0.05,**P<0.01；動物數n=3Fig.2 Relationship between different dose concentrations and sampling time points and distribution of chromosome aberration typesNote：The effects of different administration and sampling strategies on the average AC% (excluding ctg and csg,A),ACG% (including ctg and csg,B),MAC% (excluding ctg and csg,C)and PC% (D)of each group.Chi-square test，Compared with the vehicle control group at the same administration and sampling time point,* indicates P<0.05 compared with vehicle control group；**indicates P<0.01 compared with vehicle control group.The number of animals n=3.

然而，PC%未呈現劑量反應相關性。與各小組內的溶媒對照組相比，CP18 h-COL4h組、CP18 h-COL2h組的PC%未見明顯升高(P>0.05)；而CP24 h-COL4h組中，CP低、高劑量組PC%均顯著性降低(P<0.05,P<0.01)，可能與該作用條件下導致大量染色體斷裂，多倍體數相對降低有關。溶媒對照組染色體結構畸變較少，分散相更為清晰且結構相對完整，故更易觀察到多倍體的現象。因多倍體細胞數與使用COL有關，染色體畸變試驗結果無法對受試物是否誘導多倍體產生作判斷。

2.2.2不同CP給藥濃度下染色體結構畸變類型分布關系

針對不同的結構畸變類型(裂隙、斷裂和交換)進行分析發現(表3與圖3)，溶媒對照組中的結構性畸變類型絕大多數為裂隙，斷裂較少，未見染色體交換；CP低劑量組中3類結構性畸變數目明顯增加，雖大多數畸變仍表現為裂隙，但斷裂和交換的出現率相加可與之持平；在CP高劑量組中3類染色體畸變數量相近，染色體交換數目明顯增加。以上趨勢在4個不同給藥取材點均可觀察到。染色單體及染色體裂隙認為是可修復的畸變類型，通常不計入結構畸變統計中；而染色體單體及染色體斷裂是CP的最主要畸變類型，上述結果與預期及文獻報道基本相符[9]。

圖3 不同CP給藥劑量與染色體結構畸變類型分布關系注：溶媒對照組(A)、10 mg/kg CP組(B)與40 mg/kg CP組(C)各300個細胞中裂隙、斷裂及交換數匯總，動物數n=3Fig.3 Distribution of Chromosome structural aberrations in different doses of CPNote：Summary of numbers of gaps,breaks and exchanges in 300 cells of vehicle control group (A)、10 mg/kg CP group (B)and 40 mg/kg CP group (C),respectively.The number of animals n=3

表3 染色體畸變分析結果Table 3 Chromosome aberration analysis results

注：1.每組3只動物，各分析100個中期分裂相細胞，每組共統計300個細胞.2.ctg、ctb、cte：分別表示染色單體裂隙、斷裂、交換；csg、csb、cse：分別表示染色體裂隙、斷裂、交換；frg：10個以上斷片(含交換).3.AC：結構畸變細胞數(不包括裂隙)；ACG：結構畸變細胞數(包括裂隙)；MAC：多畸變細胞數(不包括裂隙)；PC：多倍體細胞數.卡方檢驗，同組0.9% NaCl對照組：*P<0.05,**P<0.01；同組CP低劑量組：#P<0.01；同劑量CP 18 h組：△P<0.05,△△P<0.01；同劑量COL組▲P<0.01
Notes：1.3 animals per group,Analysis of 100 metaphase dividing cells.A total of 300 cells were counted in each group.2.ctg/csg,ctb/csb and cte/cse represent chromatid gap/chromosome gap,chromatid break/chromosome break and chromatid exchange/chromosome exchange respectively.frg:represent more than 10 fragments (including exchange).3.AC:aberration cell (include gap);ACG:aberration cell (exclude gap);MAC:multiple aberration cell (exclude gap);PC:polyploidy cell.;Chi-square test showed that 0.9% NaCl control group in the same group;*indicatesP<0.05 compared with vehicle control group;**indicatesP<0.01 compared with vehicle control group;#indicatesP<0.01 compared with Low dose group of CP in the same group;△indicatesP<0.05 compared with the same dose of CP for 18 h group;△△indicatesP<0.01 compared with the same dose of CP for 18 h group;▲indicatesP<0.01 compared with the same dose of COL group

3 討論

與體外哺乳動物染色體畸變試驗相比，體內試驗所觀察的嚙齒類動物淋巴細胞所包含的染色體條數較多而細胞較小，因此后者需制備分散情況更好的染色體標本用于觀察。中期分裂相細胞染色體分散情況主要與給藥時間點、取材時間點、給藥濃度、低滲處理條件等有關[10-11]。本研究主要就不同的給藥劑量，給藥時間及取材時間對制片效果的影響進行對比。

染色體畸變試驗的觀察對象為處于中期分裂相的細胞，為增加中期分裂相細胞比例，早期研究中使用植物血凝素(Phytohemagglutinin，PHA)刺激細胞分裂，提高骨髓和淋巴細胞等的分裂指數[12]。OECD指導原則中建議使用紡錘絲形成抑制劑COL來獲得更多的中期分裂相細胞用于分析[6]。但COL同時也是染色體畸變的陽性劑，其劑量過高時可導致細胞核固縮，反而干擾了制片后染色體的分散效果，難以對畸變類型進行細致的觀察[13-14]。OECD指導原則及我國食品安全國家標準均建議的秋水仙素給藥時間為取材前3～5 h。而國內外文獻報道中秋水仙素實際使用劑量2～4 mg/kg不等[15-18]；為便于操作，給藥時間為取材前為1.5～4 h。本研究的結果提示雖然無論取材前4 h(4 mg/kg)或2 h(10 mg/kg)給予COL,每只動物均可獲得至少100個處于中期分裂相的細胞，但10 mg/kg的COL可誘導額外的染色體結構性畸變。而CP 18 h-COL 4 h組與CP 18 h-COL 2 h組染色體樣本中染色體分散效果較好，鏡下可觀察到較多處于中期分裂相的細胞(約占總有核細胞數的10%左右，數據未顯示)。

在CP的給藥劑量和時間的選擇方面，由于CP處理導致染色體出現較多結構性斷裂，滴片時易將多數已脹裂核膜的染色體標本斷片進一步摔碎，無法觀察。因鏡下觀察陽性劑量組染色體標本核膜脹裂不充分的情況相對較多，試驗時應合理設置CP的給藥劑量。此外，CP 24 h-COL 4 h組和CP 24 h-COL 2 h組兩組染色體分散效果相對較差，可見未成熟染色體凝縮現象，多見染色體細長，從而影響了染色體分析結果的準確性。上述情況均與給藥取材時間點與細胞周期不協同有關，因大多數細胞未處于細胞分裂中期。在這一條件下，某些結構性畸變可能被忽視，裂隙與斷裂的差異則難以區分，故陰性對照組的畸變率較低，CP 24 h-COL 4 h組和CP 24 h-COL 2 h組中的結構畸變率可能被低估。如圖2所示，CP 24 h-COL 2 h組的CP低劑量組與高劑量組間的結構性畸變率差異被弱化；CP 24 h-COL 4 h組的CP高劑量組的AC%較CP 18 h-COL 4 h組的CP高劑量組顯著增高(圖3)。故取材和給藥時間設為CP在取材前18 h給藥，COL在取材前4 h給藥較為理想。

除了給藥及取材因素外，其它制片流程也可能影響染色體分散效果。如，制片所用玻片，建議提前使用95%酒精浸泡擦拭，從而減少背景沉渣。骨髓染色體樣本經37 ℃條件下低滲處理30至60 min可完全脹裂溶解紅細胞，并充分脹裂白細胞核膜。此外，滴片高度也對染色體分散程度有一定影響。

2011年在人用藥物注冊技術要求國際協調會(International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use,ICH)頒布的藥物遺傳毒性研究技術指導原則的修訂草案ICH S2(R1)[19]中強調了體內研究可將多種遺傳毒性評價方法聯合開展。在藥物安全性評價領域，通常在骨髓微核試驗結果不明確或為陽性時開展體內染色體畸變試驗，對受試物對體內染色體損傷效應進行確認。本研究結果提示間隔24 h連續兩次給藥后18 h取材可獲得較優的染色體畸變試驗制片效果，而骨髓微核試驗亦可使用相同的給藥及取材方式。故兩者可使用同一批動物開展，從而更好地對微核試驗的結果進行驗證。而實際給藥頻率和給藥方式要根據不同受試物的實際人體使用方式、劑型、作用機制或國標要求進行調整。本研究對試驗條件的摸索積累了一定的背景數據，也為相關研究人員提供借鑒。此外，結果提示間隔24 h連續兩次給藥后18 h取材可獲得較優的制片效果。