免疫性血小板減少癥氣不攝血證小鼠模型血管內皮活性物質變化動態研究

武曲星 王攀 王冬芝 藺亞東 張伏芝 劉建勛 任鈞國

摘要：目的 ?從血管內皮活性物質角度探討免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）氣不攝血證血管損傷情況及出血機制的動態變化。方法??采用睡眠剝奪復合免疫法制備ITP氣不攝血證小鼠模型，第1周進行睡眠剝奪，第2、3周睡眠剝奪同時注射抗血小板血清（APS）進行免疫。將Balb/C小鼠分為正常組和模型組，各組再分為7、10、21 d 時間點，每個時間點正常組10只、模型組12只，觀察各時間點小鼠體征，檢測小鼠體質量及血小板、抓力、脾臟指數、胸腺指數，ELISA檢測血清血管性血友病因子（vWF）、一氧化氮（NO）、內皮素-1（ET-1）含量，AimPlex流式高通量多因子法檢測血管內皮生長因子-A（VEGF-A）、可溶性細胞間黏附分子-1（sICAM-1）、可溶性血管細胞黏附分子-1（sVCAM-1）含量。結果??與正常組比較，模型組第7日小鼠精神狀態萎靡，倦怠蜷縮，極少活動，此狀態隨時間延長日益加重，體質量、抓力、血小板、脾臟指數、胸腺指數顯著降低（P<0.01），vWF、NO、ET-1顯著升高（P<0.01）;注射APS后，模型組小鼠腹部、腿部有出血點，便血情況發生，第2次注射后出血最為嚴重，此后逐日減輕，小鼠體質量、抓力、血小板、胸腺指數、VEGF-A、sVCAM-1顯著降低（P<0.01，P<0.05），脾臟指數、vWF、NO、ET-1顯著升高（P<0.01）;第21日模型組小鼠出血較輕，體質量、抓力、血小板、胸腺指數顯著降低（P<0.01），脾臟指數、vWF、NO、ET-1、sICAM-1顯著升高（P<0.01）。結論??ITP氣不攝血證小鼠模型存在血管損傷：造模第7日以血管內皮凝血功能紊亂為主，第10日以血管內皮通透性改變為主，第21日以血管內皮免疫功能紊亂為主。

關鍵詞：免疫性血小板減少癥;氣不攝血證;血管活性物質;病證結合模型

中圖分類號：R285.5 ???文獻標識碼：A ???文章編號：1005-5304（2019）12-0056-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.12.013 ??開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Dynamic Study on Changes of Vascular Endothelial Active Substances in Mice Model of Immune Thrombocytopenia with Syndrome of Qi Failing to Control Blood

WU Quxing^1，2，?WANG Pan²， WANG Dongzhi²， LIN Yadong²， ZHANG Fuzhi^1，2，?LIU Jianxun²， REN Junguo²

1. Graduated School， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing?100029， China; 2. Beijing Key Laboratory of Pharmacology of Chinese Materia Medica， Institute of Basic Medical Sciences of Xiyuan Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100091， China

Abstract：?Objective?To explore the dynamic changes of vascular injury and bleeding mechanism of immune thrombocytopenia?（ITP） with syndrome of qi failing to control blood from the perspective of vascular?endothelial active substances. Methods?ITP with syndrome of qi failing to control blood model was built by sleep deprivation combined with immunoassay. Mice were subjected to sleep deprivation at week 1 and sleep deprivation with immunization with anti-platelet serum （APS） at week 2 and 3. Mice were divided into normal group and model group， and divided into three time points： 3?d， 10 d， 21 d. There were 10 mice in the normal group and 12 mice in the model group?at each time point. Body signs of each time point were observed and body weight， platelet， grip， spleen index， and thymus index were recorded. vWF， NO and ET-1 were measured by ELISA. VEGF-A， sICAM-1， sVCAM-1 were?measured by AimPlex flow high-throughput multifactor. Results?Compared with the normal group， after 7 days of sleep deprivation， mice in the model group were mentally depressed， tired and curled up with little activity. This state increased with the deprivation time. The body weight， grip， platelet， spleen index and thymus index of the mice significantly decreased （P<0.01）， and vWF， NO and ET-1 significantly increased （P<0.01）. After the injection of APS， the bleeding point appeared in the abdomen and legs of the mice and hematochezia occurred in mice. After the second injection， the bleeding was the most serious， and then decreased day by day， the mouse weight， the grip， the platelets， thymus index， VEGF-A and sVCAM-1 significantly decreased （P<0.01， P<0.05）， and the spleen index， vWF， NO and ET-1 significantly increased （P<0.01）. There was less bleeding?on the 21st day. The body weight， grip， platelet and thymus index of the mice significantly decreased （P<0.01）， and the spleen index， vWF， NO， ET-1 and sICAM-1 significantly increased （P<0.01）. Conclusion?Vascular injury is found in the model of ITP with syndrome of qi failing to control blood. On the 7th day， vascular endothelial coagulation dysfunction is dominant， on the 10th day， change of vascular endothelial permeability is dominant， and on the 21st day， vascular endothelial immune dysfunction is dominant.

2.2 ?造模

在前期研究基礎上，采用睡眠剝奪復合免疫方法^[8-10]進行造模。睡眠剝奪：將小鼠置于自制水平臺（水平臺規格：平臺高40 mm、底盤直徑60 mm、中間豎管直徑10 mm、頂盤直徑25 mm）上，每籠4個水平臺，放置3只小鼠。使用鐵絲網將睡眠剝奪籠蓋住并固定，保證小鼠無法逃脫，但可以移動。食物與飲用水瓶置于鐵絲網食槽內，使小鼠可自由攝食飲水，若小鼠進入睡眠狀態，會因肌肉松弛而落入水中，從而使小鼠始終保持清醒狀態。采取隨機時間段剝奪方法，平均每日剝奪19 h。每日剝奪結束后，將小鼠取出，放回鼠籠。免疫：按100 μL/20 g腹腔注射APS，隔日1次，共注射7次。造模：第1周進行睡眠剝奪，第2、3周睡眠剝奪復合注射APS免疫。

2.3 ?分組

將雄性Balb/C小鼠分為正常組和模型組，各組再分為7、10、21 d共3個時間點，正常組每個時間點各10只，模型組每個時間點各12只。模型組睡眠剝奪7 d后，在睡眠剝奪同時，每隔1 d注射APS;正常組每隔1 d注射生理鹽水。每個時間點結束后，小鼠摘眼球取血，常規制備血清，-80 ℃冰箱貯藏備用，進行相應指標檢測。

2.4 ?檢測指標

2.4.1 ?小鼠體征

觀察小鼠精神狀態、毛色、大便、出血情況等。

2.4.2 ?體質量

測量小鼠體質量。

2.4.3 ?抓力

使用大小鼠抓力測定儀測定小鼠抓力。

2.4.4 ?血小板計數

取小鼠尾靜脈血，使用全自動血細胞分析儀測量血小板數量。

2.4.5 ?臟器指數

小鼠麻醉，取脾臟、胸腺，生理鹽水沖洗后稱重。計算臟器指數。臟器指數（%）=臟器濕重（g）÷小鼠體質量（g）×100%。

2.4.6 ?ELISA檢測血清血管性血友病因子、一氧化氮和內皮素-1含量

-80 ℃冰箱取出小鼠血清，按ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測小鼠血清vWF、NO、ET-1含量。

2.4.7 ?流式法檢測血清血管內皮生長因子-A、可溶性細胞間黏附分子-1、可溶性血管細胞黏附分子-1含量

-80 ℃冰箱取出小鼠血清，按AimPlex流式高通量多因子檢測試劑盒說明書進行操作，檢測小鼠血清VEGF-A、sICAM-1、sVCAM-1含量。

3 ?統計學方法

采用SPSS20.0統計軟件進行分析。實驗數據以x（—）±s表示，組間比較用獨立樣本t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 ?結果

4.1 ?體征變化

正常組小鼠精神狀態良好，反應敏捷，活動性良好，毛色純白有光澤，大便呈黃褐色，條狀，顆粒清晰。第7日模型組小鼠精神狀態萎靡，反應遲鈍，每日停止睡眠剝奪后，倦怠蜷縮，極少活動，毛色黯黃粗糙，大便呈黑褐色或黃色，便稀，隨時間延長日益加重。第10日（注射APS后3 d），小鼠腹部、腿部出現出血點（見圖1），便血情況出現，第2次注射后，小鼠出血最為嚴重，此后逐日減輕，第21日已無出血情況。

4.2 ?體質量變化

與正常組比較，模型組小鼠3個時間點體質量均顯著降低（P<0.01），見表1。

4.3 ?抓力變化

與正常組比較，模型組小鼠3個時間點抓力均顯著降低（P<0.01），見表2。

4.4 ?血小板計數變化

與正常組比較，模型組小鼠3個時間點血小板計數均顯著降低（P<0.01），其中第10日模型組血小板計數最低，見表3。

4.5 ?脾臟指數變化

與正常組比較，模型組小鼠第7日脾臟指數顯著降低（P<0.01），第10、21日脾臟指數顯著增加（P<0.01），隨著造模時間延長，模型組脾臟指數逐漸升高，見表4。

4.6 ?胸腺指數變化

與正常組比較，模型組小鼠3個時間點胸腺指數顯著降低（P<0.01，P<0.05），見表5。

4.7 ?血清血管性血友病因子、一氧化氮和內皮素-1變化

與正常組比較，模型組小鼠3個時間點vWF、NO、ET-1均顯著升高（P<0.01），見表6～表8。

4.8 ?血清血管內皮生長因子-A、可溶性細胞間黏附分子-1和可溶性血管細胞黏附分子-1變化

與正常組比較，模型組小鼠第7日VEGF-A、sICAM-1、sVCAM-1含量差異均無統計學意義（P>0.05），第10日VEGF-A、sVCAM-1含量顯著降低（P<0.01），第21日sICAM-1含量顯著升高（P<0.01），VEGF-A、sVCAM-1含量差異無統計學意義（P>0.05），見表9～表11。

5 ?討論

氣是構成人體和維持人體生命活動的精微物質，血為脈管中流動的紅色液體，二者相互作用，保證人體機能的正常運行。在中醫理論中，血證有廣義與狹義之分，其中廣義的血證是指與血液有關的疾病，狹義的血證是指由于各種原因導致的血不循經，溢出脈外。氣不攝血是血證的常見病機，其辨證要點為出血和氣虛。由于氣的統攝作用，血液才可循行脈中，若氣虛無法統攝，血溢脈外，則會出現各類出血。

ITP為臨床常見的出血性疾病，由于自身免疫系統識別血小板表面糖蛋白并進行清除或影響血小板生成，造成血小板數量暫時或持續減少。氣不攝血證是ITP主要的證型之一。目前，ITP動物模型造模方法較多，如注射APS^[9]、抗原模擬法^[11]等，但尚無對ITP氣不攝血證小鼠模型的研究，通過對CBA/J小鼠腹腔注射哺乳后雌性Wistar大鼠提純后血小板，采用睡眠剝奪復合免疫方法進行造模，出現氣虛與血小板計數下降癥狀，但并未出現出血癥狀^[10]。僅注射APS便可出現較為明顯的出血癥狀，說明此方法可能對血管造成較大影響，為更好研究ITP氣不攝血證小鼠血管內皮的變化，本實驗采用水平臺睡眠剝奪法復合注射APS進行造模。

本實驗以小鼠體征、體質量及抓力作為判斷小鼠氣虛指標。實驗結果顯示，睡眠剝奪第7日，模型組小鼠已出現精神狀態萎靡不振、反應遲鈍、倦怠蜷縮等癥狀，體質量、抓力明顯下降，表明睡眠剝奪7 d已出現氣虛癥狀，隨時間延長，氣虛癥狀加重。注射APS后，模型組小鼠血小板迅速下降，出現較為明顯的出血點，并且有便血情況發生，表明存在消化道出血。此后隔日注射APS，出血情況日益減輕。

脾臟與胸腺是重要的免疫器官，脾臟也是血小板消除的主要器官。實驗結果顯示，睡眠剝奪第7日，小鼠脾臟指數、胸腺指數均顯著降低，表明睡眠剝奪可明顯降低免疫功能;注射APS后3 d（第10日），小鼠脾臟指數顯著升高，并隨著剝奪和注射時間的延長，小鼠脾臟指數逐漸升高，而胸腺指數則仍然顯著降低，提示脾臟指數的升高主要是由血小板消除導致的，機體的免疫功能仍然處于低下狀態。

在睡眠剝奪7 d后，模型組小鼠血小板明顯降低，表明僅進行睡眠剝奪造成小鼠氣虛狀態，也會出現血小板降低的情況。注射APS后，模型組小鼠血小板迅速下降。此后隔日注射APS，血小板出現緩慢回升，通過注射APS可維持較低的血小板計數。

vWF是一種大分子糖蛋白多聚體，多由內皮細胞產生，少部分由巨核細胞產生^[12]，其作用主要是誘導血小板的黏附與聚集，作用于血管內皮損傷部位，促進凝血;穩定凝血因子Ⅷ，作為載體形成復合物^[13-14]。vWF濃度可在一定程度上作為血管內皮損傷程度的標志物^[15]。與正常組比較，模型組血清vWF含量顯著升高，表明僅進行睡眠剝奪，血管內皮已有一定程度的損傷，注射APS和持續睡眠剝奪維持了持續性的損傷。

NO和ET-1是人體內廣泛存在的一對信號分子，在調節血管、傳遞神經信號、調節免疫系統等方面均起到重要的作用。與健康對照組比較，臨床ITP患者的NO/一氧化氮合酶（NOS）與活性氧均顯著升高，且二者呈正相關^[16]，推測NO/NOS可能是通過參與ROS產生，并增加內皮細胞通透性^[17-18]。睡眠剝奪7日后，二者顯著升高，說明小鼠內皮遭到損傷。注射APS和持續睡眠剝奪維持了較高的NO和ET-1水平。

VEGF是人體內作用最強的增加血管內皮細胞通透性因子^[19]，VEGF家族有VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C等多種亞型。在不同的出血性疾病中，VEGF表達各不相同^[20]。本實驗第10日模型組VEGF-A水平顯著降低，是由于開始注射APS，產生的刺激較強，內皮損傷較單純睡眠剝奪更嚴重，VEGF-A迅速下降。

ICAM-1與VCAM-1均為黏附分子，二者均屬免疫球蛋白超家族。ICAM-1的作用為促進免疫細胞活化，誘導淋巴細胞在血管內皮進行黏附，是淋巴細胞與內皮細胞黏附的核心分子^[21]。正常情況下，ICAM-1幾乎不在內皮細胞上進行表達。當有免疫反應發生時，分泌增多。VCAM-1與ICAM-1作用類似，可促進白細胞向血管內皮黏附。模型組第10日sVCAM-1顯著降低，第21日sICAM-1血清濃度顯著升高。表明第10日主要是血管內皮出現異常，但并未出現sVCAM-1介導的免疫反應，后期出現sICAM-1介導的淋巴細胞黏附，導致內皮細胞活化，增強內皮細胞通透性，使淋巴細胞更容易穿透血管內皮。

綜上，ITP氣不攝血證小鼠血管內皮受到一定程度損傷。在整個造模過程中小鼠vWF、NO、ET-1均升高，說明NO、ET-1異常貫穿整個造模過程;第10日（注射APS后3 d）VEGF-A和sVCAM-1水平顯著降低，此時間點出血最為嚴重，說明血小板下降迅速，導致內皮功能受損，VEGF-A與sVCAM-1的降低與出血有關;第21日sICAM-1顯著升高，說明造模后期小鼠機體反應以免疫反應為主，對內皮細胞的損傷主要是由sICAM-1誘導的淋巴細胞黏附造成。

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（收稿日期：2019-04-16）

（修回日期：2019-06-13;編輯：華強）