利用苯磺隆定向轉育甘藍型油菜抗除草劑恢復系18Z82

張超 代文東 王軍 肖華貴 唐容 黃莎 楊克相 饒勇

摘要?為選育抗磺酰脲類除草劑的甘藍型油菜波里馬細胞質雄性不育（polima cytoplasmic male sterility，pol CMS）恢復系，以pol CMS恢復系2255C為母本與抗磺酰脲類除草劑油菜M342雜交，使用苯磺隆篩選F2單株及F2∶3株系，結合F2除草劑抗性單株與pol CMS不育系的測交鑒定，成功篩選到聚合了純合的除草劑抗性基因和pol CMS恢復基因的株系，經多代自交定向選育出抗磺酰脲類除草劑的pol CMS恢復系18Z82，用18Z82配制的11個組合中有2個組合產量顯著高于油研50、有1個組合產量與油研50基本持平，表明18Z82可以用來配制高產抗草劑pol CMS“三系”組合。

關鍵詞?甘藍型油菜;磺酰脲類除草劑;波里馬細胞質雄性不育恢復系;苯磺隆

中圖分類號?S?634.3文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）23-0030-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.011

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Breeding pol CMS Restorer Line 18Z82 with Herbicide Resistant by Tribenuron?methyl

ZHANG Chao，DAI Wen?dong，WANG Jun et al

（Institute of Oil Crops，Guizhou Academy of Agricultural Sciences，Guiyang，Guizhou 550006）

Abstract?In order to breed herbicide?resistant pol CMS restorer line in Brassica napus L.，pol CMS restorer line 2255C was used as the female parent and crossed with sulfonylurea herbicide?resistant line M342.The F2 segregating population and F2：3 families were identified with tribenuron?methyl to obtain the homozygous herbicide?resistant lines，and the herbicide?resistant F2 plants were crossed with pol CMS sterile line to screen homozygous restorer plants，finally the homozygous herbicide?resistant and pol CMS restorer cross progenies were screened out.After multiple generations of self?crossing，sulfonylurea herbicide?resistant recombinant pol CMS restorer line 18Z82 was bred successfully.Yield test showed that the yield of 2 combinations was significantly higher than that of “Youyan 50” and 1 combination was the same as that of “Youyan 50” among the 11 combinations prepared by 18Z82，which indicated that the 18Z82 could be used for preparing high?yield herbicide?resistant pol CMS “three line” hybrid combinations.

Key words?Brassica napus L.;Sulfonylurea herbicides;Polima （pol） cytoplasmic male sterility （CMS） restorer line;Tribenuron?methyl

油菜是我國第一大油料作物，同時又具有菜用、蜜用、休閑觀光等多重功能[1];近年來，我國經濟發展迅速，農村勞動力缺乏，勞動力成本增加，油菜種植效益偏低。因此，減少油菜生產田間管理勞動力投入的輕簡化種植方式越來越受歡迎，但粗放的田間管理導致油菜田草害加重，有時會造成油菜嚴重減產[2]，油菜田的雜草防治已成為油菜生產面臨的棘手問題之一。采用化學除草劑可以經濟、高效地防治雜草，但目前我國尚缺乏商業化的抗除草劑油菜品種;此外，磺酰脲類除草劑具有毒性低、半衰期短、殘留少等優點，在防治油菜田中的闊葉類雜草優勢明顯[3]。因此，篩選、培育抗磺酰脲類除草劑的油菜品系已是我國當前油菜育種的重要目標之一[4]。

2010年高建芹等[5]在油菜-大豆輪作田里發現了抗磺酰脲類除草劑的自然突變油菜資源M9，經過除草劑鑒定發現其具有一定的實用價值;胡茂龍等[6]采用EMS誘變也成功創制了多個磺酰脲類抗除草劑的油菜資源;孫妍妍等[7]、Li等[8]分別在篩選EMS誘變庫和采用苯磺隆化學殺雄時發現了抗磺酰脲類除草劑的油菜種質資源，但這些種質資源的生產應用情況未見深入報道。采用EMS誘變Hu等[9]獲得了抗磺酰脲類除草劑油菜M342，研究發現其具有較高的除草劑抗性，且該M342的除草劑抗性源自BnALS3的單基因突變，抗性表現為顯性基因，因此具有較高的實用價值。波里馬細胞質雄性不育（polima cytoplasmic male sterility，pol CMS）是第一個有實用價值的油菜細胞質雄性不育類型，在油菜雜交種配制中應用廣泛[10]，而選育pol CMS恢復系是配制pol CMS“三系”品種的關鍵，研究認為油菜的pol CMS恢復基因是1對顯性基因[11]，可通過雜交來進行恢復基因的轉移。鑒于此，筆乾采用pol CMS恢復系2255C與抗磺酰脲類除草劑種質M342進行雜交，在F2分離世代采用苯磺隆鑒定抗性單株并按單株與pol CMS不育系測交，結合測交組合的育性情況及F2∶3株系的除草劑抗性情況，篩選聚合了純合除草劑抗性基因及pol CMS恢復基因的株系，經過多代自交定向選育成穩定的抗除草劑pol CMS恢復系，并與pol CMS不育系配制組合，為選育抗除草劑pol CMS“三系”品種打下基礎。

1?材料與方法

1.1?供試材料

甘藍型油菜抗磺酰脲類除草劑種質M342[9]由江蘇省農業科學院經濟作物研究所提供，2255C為貴州省油料研究所利用從華中農業大學引進的5300C與7005C（黔油15號恢復系）雜交選育而成的雙低pol CMS恢復系，pol CMS不育系J068A 、LDX370A、LDX374A、LDX380A、LDX414A、LDX422A、LDX6-18A、LDX82-11A、LDX92-11A、LDX95-58A、常規03A由貴州省油料研究所李大雄研究員提供，組合比較對照品種油研50（CK）由貴州省油菜研究所張瑞茂研究員提供。

1.2?試驗材料田間種植?F2分離群體種植：按2 m寬、10 m長廂面均勻撒播，3～6葉期噴施苯磺隆，噴施14 d后選抗性單株按行長2 m、行距40 cm、株距25 cm移栽。轉育后代田間種植：行長2 m、行距40 cm、每行按穴距25 cm小穴點播3～5粒油菜種子，3～6葉期定苗，每穴留苗1株。測恢組合種植：行長2 m、行距40 cm、每行按穴距25 cm小穴點播3～5粒油菜種子，不勻苗，花期調查育性。pol CMS“三系”組合鑒定試驗：設置5行1小區，隨機區組排列，3次重復，對照品種為油研50;行長2 m、行距40 cm、每行按穴距25 cm小穴點播3～5粒油菜種子，3～6葉期定苗，每穴留苗1株。

1.3?除草劑抗性鑒定?幼苗3～6葉期，采用苯磺隆（有效成分10%，可濕性粉劑）按18 g a.i./hm2的用量噴施，14 d后調查死亡情況和受抑制情況。

1.4?抗除草劑pol CMS恢復系18Z82的選育過程

2015年春選2255C做母本，以M342為父本，人工去雄雜交獲得F1雜交種后在貴州省威寧縣加代，收獲自交種后于2015年9月底在貴州省油料研究所貴陽試驗地種植形成F2分離群體，于幼苗3～6葉期噴施苯磺隆除草劑，淘汰不抗除草劑單株，2016年春選擇健壯的抗除草劑單株套袋自交，并按單株取花粉與pol CMS不育系測交。2016年5月收獲F2單株自交種及測交組合到威寧進行夏繁，F2自交種形成的F2∶3株系苗期采用苯磺隆除草劑鑒定，淘汰不抗株系及有抗/不抗植株分離的株系;測交組合于花期調查育性，淘汰100%不育及有可育/不育分離的測交組合所對應的F2∶3株系，最終選擇100%可育組合所對應的抗除草劑F2∶3株系套袋自交。經過品質分析、夏繁加代、套袋自交至F7代選整齊穩定株系18Z82與pol CMS不育系配制組合，2018年9月種植18Z82的F8株系及配制組合，進行苗期苯磺隆除草劑抗性鑒定及花期恢復性鑒定，確定18Z82為新選育的抗磺酰脲類除草劑pol CMS恢復系。選育流程見圖1。

1.5?農藝性狀調查

成熟期，自交系、組合比較試驗各小區隨機取10株，采用常規方法考察株高、一次有效分枝高度、一次有效分枝數、主花序長、主花序角果數、單株有效角果數，每株取一次分枝中部30個角果計算每角果粒數，單株脫粒測量單株籽粒產量并測量千粒重;采用FOSS NIR System近紅外分析儀（美國）進行品質分析;考種取樣后按小區收獲并測量小區產量。

1.6?數據處理?用Excel 2013匯總整理數據，采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析。

2?結果與分析

2.1?抗除草劑pol CMS恢復系18Z82的選育

以2255C為母本、M342為父本配制雜交組合，采用苯磺隆除草劑鑒定發現M342及F1表現為抗除草劑，而2255C在噴施除草劑后14 d葉片發紅變黃，逐漸死亡（圖2）。種植F2分離群體于苗期（3～6葉期）噴施除草劑篩選出抗除草劑單株157株，盛花期選抗性單株套袋自交并取花粉與pol CMS不育系測交。種植F2抗性單株自交種形成F2∶3株系，于苗期（3～6葉期）噴施苯磺隆除草劑，14 d后調查發現F2∶3株系分3種類型，第1種類型為噴藥后100%抗除草劑;第2種類型為噴藥后葉片發紅、變黃死亡不抗除草劑;第3種類型為出現抗/不抗除草劑單株分離（圖2），根據除草劑鑒定情況獲得100%抗苯磺隆除草劑F2∶3株系53個;盛花期調查抗除草劑的F2單株與pol CMS不育系測交組合的育性情況，發現157個測交組合的育性情況也分3種類型，其中全可育組合32個，全不育組合52個，有可育/不育分離的組合73個;綜合發現，32個全可育組合對應的F2∶3株系中有7個表現為100%抗苯磺隆除草劑，對這7個株系套袋自交至F7，發現2018年夏繁編號為18Z82的株系整齊一致，株高、生育期適中，分枝多，株型緊湊，品質“雙低”，隨后利用18Z82與貴州省農業科學院貴州省油料研究所選育的pol CMS不育系配制雜交組合，經除草劑鑒定及恢復性鑒定表明18Z82為新選育的抗除草劑pol CMS恢復系。

2.2?18Z82及親本的農藝性狀

成熟期農藝性狀調查結果見表1。由表1可知，，選育的18Z82分枝高度、含油量、芥酸含量及硫代葡萄糖苷的含量與親本2255C、M342間差異不顯著;18Z82的株高、二次有效分枝數、主花序長、主花序角果數及單株角果數均顯著高于M342而低于2255C;18Z82每角粒數、千粒重及生育期接近親本2255C，單株產量均顯著低于2個親本。綜上所述，18Z82的綜合性狀接近2255C與M342的中間類型。

2.3?抗除草劑pol CMS恢復系18Z82的應用

利用新選育的pol CMS恢復系18Z82與11個優良pol CMS不育系配制組合，苗期采用苯磺隆鑒定發現對照品種油研50不抗除草劑，配制的11組合均表現較強的除草劑抗性。成熟期考種農藝性狀見表2。由表2可知，18Z82與LDX95-58A及LDX6-18A配制的組合小區產量顯著高于對照品種油研50，18Z82與J068A配制的組合產量與油研50基本持平，而18Z82與其他不育系配制的組合產量都顯著低于對照，表明恢復系18Z82可以配制高產組合。利用18Z82配制的11個pol CMS“三系”組合及對照品種的小區產量與各主要農藝性狀的相關性分析可知，小區產量與各農藝性狀的相關性由大到小依次為：單株角果數（r=0.815）>一次分枝數（r=0.680）>千粒重（r=0.659）>主花序角果數（r=0.628）>每角粒數（r=0.618）>主花序長（r=0.598）>二次分枝數（r=0.582）>株高（r=0.471）>分枝高度（r=0.068）>含油量（r=-0.042）>硫代含量（r=-0.365）>芥酸含量（r=-0.435）。其中，小區產量與單株角果數呈極顯著正相關，小區產量與一次分枝數、千粒重、主花序角果數、每角粒數、主花序長、二次分枝數等農藝性狀均呈顯著正相關，與株高、分枝高呈正相關但未達到顯著水平，而小區產量與含油量、芥酸含量及硫代含量呈不顯著的負相關。因此，在恢復系的選育中要著重選育一次分枝數、千粒重、主花序角果數、每角粒數、主花序長、二次分枝數等農藝性狀配合力高的材料。

3?討論

利用除草劑進行油菜田的雜草防治可以顯著降低油菜生產成本，減少因雜草造成的產量損失，但目前我國尚缺乏可用于生產的抗除草劑pol CMS “三系”雜交油菜品種，因此，選育抗除草劑pol CMS恢復系意義重大。M342為單基因控制的顯性磺酰脲類除草劑抗性油菜種質，具有較高除草劑抗性[9]，pol CMS恢復基因同樣也為顯性單基因[11]，采用雜交轉育的方法聚合M342中的除草劑抗性基因及pol CMS恢復系中的恢復基因在理論上可行，但選育過程工作量較大。因此，該研究對F2分離群體進行苯磺隆除草劑處理，淘汰不抗除草劑單株，保留抗性單株，縮小了選育范圍;對F2單株進行測恢，可以有針對性的篩選攜帶純合pol CMS恢復基因的抗性單株;結合F2∶3株系的除草劑鑒定，可以排除攜帶雜合除草劑抗性基因的株系，最終在F2∶3世代就可以篩選到聚合了純合的除草劑抗性基因、pol CMS恢復基因的轉育材料，從而顯著提高了恢復系的選育效率。

農藝性狀調查顯示，該研究選育的18Z82的株高、二次有效分枝數、主花序長、主花序角果數及單株角果數等性狀為2個親本的中間類型，表明18Z82綜合了2個親本的部分優良性狀，但仍有進一步改良的空間，可以采用轉育后代與優良親本回交的策略進一步改良親本攜帶的優良性狀，例如閆宏山等[12]利用轉育后代與親本回交的方法成功選育了抗除草劑的谷子新品種。18Z82的角粒數接近母本2255C，這可能是因為油菜角粒數受母本的影響較大[13]。18Z82與貴州省農業科學院貴州省油料研究所選育的11個優良pol CMS不育系配制的組合中，有2個組合小區產量顯著高于油研50，1個組合與油研50產量差異不顯著，表明可以利用18Z82配制高產組合。配制的組合小區產量與單株角果數呈極顯著正相關，這與楊國浪等[14]的研究結果一致;此外，該研究發現組合的小區產量與一次分枝數、千粒重、主花序角果數、每角粒數、主花序長、二次分枝數等農藝性狀均呈顯著正相關;白桂萍等[15]研究也認為油菜高產主要依靠較多的分枝數和角果數，同時兼顧千粒重;塔娜等研究認為在油菜高產育種中，首先需要加強單株生物量、千粒重和角果粒數的選擇，其次是株高、分枝高度、一次有效分枝數、主花序長度和主花序角果數等性狀的改良[16]。因此，單株角果數、一次分枝數、千粒重、主花序角果數、每角粒數、主花序長、二次分枝數等農藝性狀與產量性狀密切相關，在恢復系的選育中應重點關注這些農藝性狀的改良。

4?結論

以pol CMS恢復系2255C與抗磺酰脲類除草劑種質M342配制雜交組合，利用苯磺隆除草劑鑒定F2分離群體及F2∶3株系，同時結合F2抗性單株與pol CMS不育系的測交育性鑒定，可以高效、定向選育抗除草劑的pol CMS恢復系，利用新選育的抗除草劑pol CMS恢復系18Z82可以配制高產抗草劑pol CMS“三系”組合。

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