基于Biolog ECO板技術的小麥內生菌多樣性研究

何玲敏 蔡新 毛鑫鑫 李楠 馬曉杰 張俊輝 吳秋芳 游新勇

摘要?采用Biolog ECO板法研究小麥不同生育期、不同器官的內生菌多樣性。結果表明，小麥整個生長周期中，葉部內生菌多樣性水平顯著高于根、莖部位;揚花期小麥內生菌多樣性水平較高，其次是苗期和成熟期;且各組織部位內生菌種群豐度和均一度均較高。該研究了解了小麥各生育期、各器官內生菌的多樣性，為小麥內生菌多樣性與宿主關系的進一步研究奠定基礎，同時為小麥病蟲害的生物防治提供材料。

關鍵詞?小麥;內生菌;Biolog ECO;生物多樣性

中圖分類號?S?182文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）23-0157-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.045

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Biodiversity Research of Wheat Endophytic Bacteria Based on Biolog ECO Plate Method

HE Ling?min，CAI Xin，MAO Xin?xin et al?（College of Biology and Food Engineering，Anyang Institute of Technology， Anyang，Henan 455000）

Abstract?The endophytic bacteria diversity in different growth stages and organs of wheatwas studied using Biolog ECO plate method.The results showed that the diversity of endophytic bacteria in leaves was significantly higher than that in roots and stems during the whole growth phase of wheat.The diversity of endophytic bacteria in wheat was the highest in the flowering stage，followed by that in the seedling stage and mature stage.Moreover，the abundance and uniformity of endophytic bacterial species were all high.This study discussed the diversity of endophytic bacteria in different growth stages and organs of wheat，which laid a foundation for further research on the relationship between endophytic bacteria diversity and the host plant，and provided materials for biological control of wheat diseases and pests.

Key words?Wheat;Endophytic bacteria;Biolog ECO;Biodiversity

小麥是我國重要糧食作物之一，其體表和體內寄居著多種微生物。小麥在生長過程中與內生菌形成和諧共生的微生態體系，內生菌次生代謝產物具有抗病、防蟲與促生等重要作用[1]。隨著植物微生態學的發展，人們更加重視利用微生物進行小麥病害生物防治的研究和應用。

植物內生菌種類多樣，普遍存在于各種水生和陸生植物中[2]。目前已在苔蘚[3]、藻類[4]、地衣[5]、蕨類[6]以及大量的裸子植物[7]和被子植物[8]中分離到內生菌。在所有植物中尤其以高等植物中的內生菌最為豐富。植物內生菌主要分布于植物的根、莖、葉、葉鞘、花、種子等器官的細胞間隙或組織間隙。不同植物由于受到株齡、種類、基因型、生長地點、生育期、氣候條件、周圍其他植物類群等條件的影響，其內生菌的數量、種類和分布往往不同，研究證明寄主植物與內生細菌組成和多樣性存在密切關聯[9-10]。同時，同種農作物內生菌在不同器官的分布有很大差異，而且內生菌在植物體內并不是永遠穩定的，它會隨著環境變化而改變[11]。在植物不同生長階段，其內生菌的數量會有所差異。隨著植物的不斷生長，其組織內部的生理特征、外部表型特征發生改變，導致不同內生細菌種群特征和分布也隨之發生變化。

Biolog ECO板是一種包含31種碳源和一個空白對照，共3個平行的96孔板。當微生物利用孔中的碳源進行呼吸代謝時，包含在碳源中的四唑紫染料會發生還原反應，孔的顏色隨之發生變化。Biolog ECO板技術操作簡便、靈敏度高，且可最大限度地保留微生物群落原有的代謝特征，常用于環境微生物活性和功能多樣性的研究[12]。小麥內生菌對小麥生長、發育和抗逆過程起著至關重要的作用，且在植物病害生物防治中具有重要地位[13]。因此，研究小麥不同生育期、不同器官的內生菌多樣性，可為小麥內生菌多樣性與宿主關系的進一步研究奠定基礎，同時為小麥病蟲害的生物防治提供材料。

1材料與方法

1.1?材料

1.1.1?小麥品種。供試小麥品種為安陽工學院培育的AG1218。

1.1.2?培養基及組成。

內生細菌分離培養基為胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）;配方：胰蛋白胨 15.0 g/L，大豆蛋白胨 5.0 g/L，氯化鈉 5.0 g/L，瓊脂 15.0 g/L，pH 7.3。

內生真菌分離培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）;配方：馬鈴薯浸粉 3.0 g/L，葡萄糖 20.0 g/L，瓊脂 14.0 g/L，pH 5.6。

1.1.3?試劑。75%乙醇，95%乙醇，0.1%升汞，次氯酸鈉（有效氯3.0%）。

1.2?方法

1.2.1?小麥樣品采集及處理。

分別在小麥苗期、揚花期、成熟期，采用5點取樣法，每點取10株。采集樣本時將小麥植株連根拔起（保持根部完整）輕輕抖落根部的大塊土壤后裝入無菌自封袋，并做好標記，放入冰盒冷藏。帶回實驗室后立即處理，或置于-80 ℃冰箱保藏備用。

1.2.2?小麥植株體表最適消毒方法的建立。

消毒方法1：材料在75%乙醇中浸泡l min后，用無菌水沖洗3次，然后用次氯酸鈉浸泡（各部位時間不同：根50 s～4 min，莖50 s～3 min，葉50 s～3 min，籽粒3～5 min），再用75%乙醇浸泡30 s，之后用無菌水清洗3次，用無菌濾紙吸干表面水分[14]。

消毒方法2：將材料浸入95%乙醇溶液中30 s，再轉入消毒劑（95%乙醇∶次氯酸鈉溶液=1∶1）中浸泡10 min取出，無菌水沖洗3次[15]。

消毒方法3：稱取小麥根、莖、葉、籽粒各1.5 g（鮮重），用自來水沖洗干凈，75%乙醇表面消毒30 s后，再用0.1%升汞進行表面消毒（根部6～8 min，莖4～5 min，葉2～3 min），無菌水沖洗5～6次后晾干[16]。

1.2.2.1?小麥內生菌菌懸液的制備。

取2 g表面消毒后的小麥樣本，轉入盛有5 mL無菌水的滅菌研缽中，充分研磨，靜置5 min，上清液即為小麥內生菌混合菌懸液。

1.2.2.2?小麥內生菌的分離和培養。

取上述菌懸液1 mL，梯度稀釋10-1～10-6，取100 μL不同濃度梯度的稀釋液分別涂布于TSA平板（分離細菌）和PDA平板（分離真菌）上，每處理重復5次，倒置于28 ℃恒溫箱中培養，3 d后進行菌落觀察，并統計菌落數量和形態。

1.2.2.3?小麥體表消毒效果檢驗。

將消毒后的組織置于5 mL無菌水中振蕩1 min，取100 μL懸浮液涂布于分離培養基上，倒置于28 ℃恒溫箱中培養3 d，記錄是否有菌落生長。

1.2.3?Biolog ECO板法測定小麥內生菌多樣性。

當微生物利用孔中的碳源進行呼吸代謝時，孔的顏色隨之發生變化。微生物的整體活性用每孔顏色平均變化率（average well color development，AWCD）來描述，碳源利用程度越大，AWCD值越大。用McIntosh指數、Shannon指數和Simpson指數對小麥各生長期、各組織部位內生菌的功能多樣性、種群豐度和均勻度進行評估。McIntosh指數、Shannon指數和Simpson指數的具體描述及計算公式見表1。

取10-3稀釋液接種至Biolog ECO板上，每孔接種量為150 μL。將生態板于25 ℃恒溫培養7 d，期間每隔24 h用Biolog自動讀板儀在590 nm下讀取OD值，根據表1中的公式計算各指數。由AWCD值、McIntosh指數、Shannon指數和Simpson指數共同評估不同生長期、不同組織部位小麥內生菌的群落多樣性。

2?結果與分析

2.1?小麥植株體表最適消毒方法

通過對常用的3種小麥組織表面消毒方法進行比較，篩選出小麥根、莖、葉、籽粒組織部位的最適表面消毒方法。用IBM SPSS Statistics 20.0軟件對平板菌落數量及種類進行多重比較分析（Tukey檢驗法，P<0.05）。

由圖1a和1c可知，無論是小麥根、莖、葉部位還是籽粒部位，采用消毒方法3消毒小麥植株體表，平板涂布法分離得到的小麥內生細菌和內生真菌的數量均介于消毒方法1和消毒方法2之間。消毒方法1分離得到的內生細菌數量最多，而消毒方法2篩選得到的內生真菌數量最多。

由圖1b和1d可知，小麥根、莖、葉、籽粒組織，采用消毒方法3分離得到的細菌種類和真菌種類均顯著高于消毒方法1和消毒方法2。

綜上所述，消毒方法3的消毒能力和作用時間分離得到的小麥內生細菌和內生真菌的數量和種類均較優。因此，采用消毒方法3對小麥體表進行消毒，從而準確評估小麥各生長期、各器官內生菌的多樣性。

2.2?小麥內生菌多樣性評估

利用Biolog全自動微生物鑒定儀測定小麥各生長期、各器官內生菌的多樣性。由圖2可知，小麥整個生長周期中，葉部內生菌的多樣性水平遠高于根、莖部位，而根、莖部位內生菌多樣性水平較接近且變化幅度較小;而揚花期葉部內生菌多樣性水平較高，其次是苗期和成熟期。

用McIntosh指數、Shannon指數和Simpson指數對小麥各生長期、各器官內生菌的功能多樣性、種群豐度和均勻度進行評估。由圖3可知，小麥各生長期葉部的McIntosh指數和Shannon指數均顯著高于根部和莖部，而根、莖、葉和籽粒部位的McIntosh指數、Shannon指數和Simpson指數差異不大。由此可知，在小麥整個生長周期中，葉部內生菌多樣性水平最高，且各組織部位內生菌種群豐度和均一度均較高。

3?結論與討論

在小麥內生菌分離過程中，表面消毒方法很關鍵。植株表面消毒方法不當，可能混入部分體表菌，導致內生菌的數量或種類偏多;或使部分內生菌被殺死，導致內生菌的數量或種類偏少。因此，使用合適的表面消毒方法對保證小麥內生菌的分離效果非常必要[17]。該研究對小麥體表消毒方法進行了篩選，得到最適的小麥體表消毒方法：稱取小麥根、莖、葉、籽粒各1.5 g（鮮重），用自來水沖洗干凈，75%乙醇表面消毒30 s后，0.1%升汞消毒（根部6～8 min，莖4～5 min，葉2～3 min），無菌水沖洗5～6次后晾干，然后進行組織研磨、平板涂布。整個消毒過程均在無菌操作臺中進行。

隨著小麥的不斷生長，其組織內部的生理特征、外部表型特征、環境變化等，導致不同內生菌種群特征和分布也隨之發生變化。該研究采用Biolog ECO板技術評估小麥品種AG1218的內生菌多樣性，結果表明，在小麥整個生長周期中，葉部內生菌多樣性水平顯著高于根、莖部位，而根、莖部位內生菌多樣性水平較接近且變化幅度較小;揚花期小麥內生菌多樣性水平較高，其次是苗期和成熟期;且各組織部位內生菌種群豐度和均一度均較高。該研究結果與前人相關研究結果一致[13-14，16]。

小麥抽穗揚花期是小麥由營養生長完全轉化為生殖生長的標志，也是決定麥穗籽粒多少的關鍵期。該階段是小麥需水、肥的高峰期，水肥供應充足，小麥內生菌也會快速增殖，故在小麥揚花期時內生菌多樣性水平較高。小麥揚花期葉片部位存在大量的內生菌，這可能與葉片光合作用有關。

同時，在對小麥品種AG1218內生菌多樣性研究中，還篩選到幾株對小麥赤霉病菌有較強拮抗作用的內生菌。下一步將對這些拮抗菌株的生防能力及對小麥赤霉病的生防效果進行研究，深入探討拮抗菌對小麥赤霉病的生物防治機理，旨在為小麥赤霉病的生物防治提供候選菌株。

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