基于均勻設(shè)計(jì)法的枯草芽孢桿菌me-1的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

蘇榮榮 楊武 王威 趙輝 陳美杉 羅坤

摘要?為提高枯草芽孢桿菌me-1對(duì)食用菌綠霉病的防治效果，以常見綠霉病病原真菌長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）為指示菌，采用單因素試驗(yàn)和均勻設(shè)計(jì)法對(duì)菌株me-1發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源、無機(jī)鹽進(jìn)行了篩選及優(yōu)化，最終確定其最適發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉35 g，蛋白胨20 g，水1 000 mL，pH 7.2，培養(yǎng)條件：30 ℃， 150 r/min，接種量7.0%。優(yōu)化后對(duì)木霉的抑菌率達(dá)94.55%，比優(yōu)化前提高了38.03%。選用優(yōu)化后的培養(yǎng)基，繪制菌株生長曲線，結(jié)果表明，其發(fā)酵液培養(yǎng)3.0 d至3.5 d可使菌株me-1的菌量達(dá)到最大。該研究結(jié)果為枯草芽孢桿菌me-1的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞?枯草芽孢桿菌;長枝木霉;發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化;均勻設(shè)計(jì)

中圖分類號(hào)?S?476文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2019）23-0164-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.047

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Optimization of Fermentation Medium for Bacillus subtilis me?1 Based on Uniform Design

SU Rong?rong1，YANG Wu2，WANG Wei2 et al

（1.Institute of Edible Fungi，Hunan Agriculture University，Changsha，Hunan410128;2.College of Plant Protection，Hunan Agriculture University，Changsha，Hunan410128 ）

Abstract?To improve the control effect of Bacillus subtilis against Trichoderma，the optional fermentation medium of me?1 for the production of antimicrobial substance were soluble starch 35 g，peptone 20 g，water 1 000 mL，pH 7.2 under the culture conditions：fermentationtemperature 30 ℃，rotation speed 150 r/min ，amount of inoculation 7% and twodays cultivation through single?factor test and uniform design. Because of the optimization，the inhibitory rate reached 94.55%，which increased by 38.03% before the optimization.Furthermore，the growth curve of me?1 was drawn through six days cultivation by using the optimized medium，the results showed that the amount of me?1 could reach the maximum by the cultivation between 3.0 days and 3.5 days.The results of this experiment provided useful information forthe industrial production of me?1.

Key words?Bacillus subtilis;Trichoderma longibrachiatum;Optimization of fermentation medium;Uniform design

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一類廣泛存在于不同環(huán)境中需氧型革蘭氏陽性菌，可產(chǎn)生內(nèi)生芽孢，抗逆性強(qiáng)，能產(chǎn)生70多種抗菌物質(zhì)，如肽類、脂肽類和氨基酸類等多種化合物[1-3]，其防病機(jī)制包括競爭作用、誘導(dǎo)植物抗性和拮抗作用等方面，在植物病害防治方面具有廣泛的應(yīng)用[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌對(duì)香蕉枯萎病、小麥紋枯病、煙草赤星病等真菌性病害，煙草青枯病等細(xì)菌性病害和煙草花葉病毒等病毒性病害均有較好的防治效果[6]。木霉是國內(nèi)外食用菌大規(guī)模人工栽培和菌種生產(chǎn)中為害嚴(yán)重的一種真菌性病害[7-8]，其適應(yīng)性強(qiáng)，繁殖速度快，可侵害香菇、杏鮑菇、黑木耳等食用菌，造成嚴(yán)重減產(chǎn)甚至絕收[9-10]。筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期篩選獲得一株木霉拮抗菌枯草芽孢桿菌me-1，能有效防治食用菌綠霉病。為提高拮抗菌me-1對(duì)綠霉病的防治效果，筆者通過單因素試驗(yàn)法和均勻設(shè)計(jì)法相結(jié)合的方式對(duì)枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，并以O(shè)D600為指標(biāo)繪制其生長曲線，旨在為菌株me-1的規(guī)模化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?供試菌株。供試病原真菌長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）和供試菌株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）為筆者前期研究分離。

1.1.2?供試培養(yǎng)基。供試細(xì)菌與真菌的培養(yǎng)分別采用LB培養(yǎng)基、馬鈴薯瓊脂葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)液為LB液體培養(yǎng)基，發(fā)酵初始培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、pH 7.2。

3?討論

目前，關(guān)于微生物培養(yǎng)基優(yōu)化的方法有單因子設(shè)計(jì)、正交設(shè)計(jì)、均勻設(shè)計(jì)、Plackett-Burman 設(shè)計(jì)等[15]。均勻設(shè)計(jì)（uniform design）是1978年由方開泰等[16]中國專家提出來的，其出發(fā)點(diǎn)是將設(shè)計(jì)點(diǎn)均勻地分散在試驗(yàn)范圍內(nèi)，所用試驗(yàn)點(diǎn)不多卻能使積分值得到較好的近似，與正交設(shè)計(jì)不同，當(dāng)試驗(yàn)因素較多時(shí)可顯著減少試驗(yàn)次數(shù)，其試驗(yàn)結(jié)果不具有整齊可比性，但可結(jié)合回歸分析得到較為精準(zhǔn)的結(jié)果[17-18]。

對(duì)拮抗菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化可以提高其對(duì)相關(guān)病原菌的防治效果，而目前關(guān)于枯草芽孢桿菌對(duì)食用菌木霉的拮抗作用鮮有報(bào)道。高越等[19]通過單因子試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法對(duì)枯草芽孢桿菌GS8菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后GS8菌株發(fā)酵濾液對(duì)葡萄炭疽病菌的抑制率提高13.1%。張璐等[20]通過單因子碳源、氮源試驗(yàn)與正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后枯草芽孢桿菌對(duì)芒果炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）抑菌圈直徑達(dá)27.3 mm，較優(yōu)化前提高了13.3 mm。陳丹等[21]通過單因子變量法和均勻設(shè)計(jì)法對(duì)菌株CZB40極暗黃鏈霉菌（Streptomyces fulvissimus）進(jìn)行發(fā)酵條件研究，經(jīng)優(yōu)化后，菌株CZB40無菌濾液的10倍稀釋液對(duì)水稻紋枯菌絲生長抑制率最高，達(dá)94.85%，比優(yōu)化前明顯提高。

該研究通過單因素試驗(yàn)和均勻設(shè)計(jì)法對(duì)菌株me-1的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，最終選定可溶性淀粉為最優(yōu)碳源，蛋白胨為最優(yōu)氮源，CaCO3為最優(yōu)無機(jī)鹽，并確定了其最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基為可溶性淀粉35 g，蛋白胨20 g，水1 000 mL，pH 7.2，培養(yǎng)條件：30 ℃，150 r/min，接種量為7%。以優(yōu)化后的培養(yǎng)基為液體發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌發(fā)酵液過濾液對(duì)木霉的抑菌率達(dá)94.55%，比優(yōu)化前提高了38.03%。選用優(yōu)化后的培養(yǎng)基，繪制菌株生長曲線，結(jié)果表明，其發(fā)酵液培養(yǎng)3.0～3.5 d可使菌株me-1的菌量達(dá)到最大。該研究為枯草芽孢桿菌me-1的工業(yè)化生產(chǎn)以及食用菌綠霉病害的有效防治提供理論依據(jù)。

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