HPLC測定不同套種模式下雷公藤不同部位甲素含量

李云鴿 喬一娜 張力 陳禮光 何天友 倪樂 鄭郁善

摘要?[目的]以厚樸/雷公藤（處理①）、杉木/雷公藤（處理②）、馬尾松/雷公藤（處理③）為3種套種模式，雷公藤純林為CK對照組，建立不同套種模式下雷公藤甲素的HPLC測定方法，并對不同套種模式下雷公藤不同部位甲素的含量進行比較。[方法]采用高效液相色譜法（HPLC），色譜柱為SinoChrom ODS-BP（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相為甲醇-水（體積比45∶55）;流速1.0 mL/min;檢測波長218 nm;柱溫40 ℃;進樣量20 μL。[結果]該方法能在8 min左右實現雷公藤甲素的快速分離，雷公藤甲素濃度在1.55～248.00 μg/mL與峰面積線性關系良好（R2=0.999 7），平均加樣回收率為99.6%，RSD為1.85%（n=6）。[結論]該方法易操作、分析速度快、重現性好、準確率高，可作為雷公藤甲素含量的測定方法。不同套種模式下雷公藤甲素總含量從高到低依次為處理①、CK、處理②、處理③，雷公藤不同部位的雷公藤甲素含量從高到低依次為根、葉、莖，說明厚樸林下套種雷公藤的模式可提高雷公藤甲素的含量，因此可作為優質林藥間作模式廣泛推廣。

關鍵詞?套種;雷公藤甲素;含量測定;高效液相色譜法

中圖分類號?R?284文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）23-0219-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.063

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Determination of Triptolide in Different Parts of Tripterygium wilfordii in Different Interplanting Patterns by HPLC

LI Yun?ge1， QIAO Yi?na2， ZHANG Li1 et al

（1.College of Landscape Architecture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002; 2.College of Forestry， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002）

Abstract?[Objective] There were three interplanting patterns of Magnolia officinalis/ Tripterygium wilfordii （Treatment 1）， Cunninghamia lanceolata/ Tripterygium wilfordii （Treatment 2）， Pinus massoniana/ Tripterygium wilfordii （Treatment 3）， and the pure forest of Tripterygium wilfordii was CK control group. HPLC method for the determination of triptolide in different interplanting patterns was established， and compared triptolide content in different parts of Tripterygium wilfordii. [Method]High performance liquid chromatography method was used， a SinoChrom ODS?BP 5 μm column （4.6 mm×250 mm）was used at 40 ℃; mobile phase was methanol?water（volume ratio 45：55）; the flow rate was 1. 0 mL/min; the detection wavelength was 218 nm; the injection volume was 20 μL. [Result]The method could achieve rapid separation of triptolide in about 8 minutes. A good linear was obtained within the range of 1.55-248.00 μg/mL（R2=0.999 7）， the average recovery was 99.6%（RSD=1.85%， n=6）.[Conclusion]The method is easy to operate， has fast analysis speed， good reproducibility and high accuracy， and can be used as a method for determining the content of triptolide. The order of total content of triptolide in different interplanting patterns is treatment 1>CK>treatment 2>treatment 3， and the order of triptolide in different parts of Tripterygium wilfordii is root>leaf>stem. It shows that the model of Tripterygium wilfordii under Magnolia officinalis can increase the content of triptolide， so it can be widely promoted as a high quality forest medicine interplanting pattern.

Key words?Intercropping;Triptolide;Content determination;High performance liquid chromatography

雷公藤（Tripterygium wilfordii），是衛矛科常見的有毒蜜源植物，是我國傳統醫學中常用的中草藥之一。雷公藤甲素，又名雷公藤內酯醇（triptolide，T10），外觀呈白色針狀結晶體，是雷公藤中含量最高、活性和毒性最強的二萜類原生化合物[1]，常作為需求量大的雷公藤片、雷公藤多苷片的主要成分[2]。臨床研究發現，雷公藤甲素及其衍生物可通過多靶點多途徑改善多種疾病，具有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤、抗生育、抗病毒、神經組織保護等作用[3-4]。因其在科研的廣泛應用和長期無序采挖致使野生資源急劇減少，供不應求[5]，即使雷公藤甲素可生物合成，但其存在合成路線長、獲得率低、反應條件不易創造等局限性，所以從植物中提取雷公藤甲素依然是首要途徑[6]。

林藥間作套種模式是復合農林業生態系統的重要組成部分，既能提高林地利用率又可保證藥用植物資源的合理化種植，可調整林分結構，增加林分內生物多樣性，改善土壤條件，提高單位面積的生物總產量[7-10]，其在實現土地經濟效益最大化的同時兼顧生態效益[11]。目前，有關雷公藤的研究多集中于其活性成分在臨床醫學研究中的應用，如Yang等[12]研究了甘草酸與雷公藤甲素聯合使用以減輕臟器毒性，王爍陽等[13]利用雷公藤甲素改善內毒血癥大鼠心血管功能損傷，僅張亮等[14]、李漢保等[15]研究了雷公藤不同部位的雷公藤甲素含量差異較大。但針對雷公藤生態栽培模式影響雷公藤甲素含量的研究較少，因此筆者以套種在厚樸、杉木、馬尾松林下的雷公藤及雷公藤純林作為試驗對象，建立雷公藤甲素含量的測定方法，并對不同套種模式下的雷公藤不同部位甲素含量進行對比分析，以期為雷公藤甲素的提取與分離及雷公藤優質套種經營模式提供科學依據。

1?材料與方法

1.1?試驗材料與地點

試驗中均以6年生雷公藤作為試材，馬尾松、厚樸、杉木均是同年栽植，長勢良好。

設置4個處理：雷公藤純林（CK）為對照組、厚樸和雷公藤套種（處理①）、杉木和雷公藤套種（處理②）、馬尾松和雷公藤套種（處理③），樣地規模均為20 m×20 m，3次重復。

試驗地點為福建省三明市泰寧縣杉城鎮邱洪村（玉溪工區）雷公藤種植基地，位于26°56′N、117°09′E，亞熱帶季風氣候，年均氣溫15.5～17.2 ℃，最高氣溫38.9 ℃，最低氣溫-10.6 ℃，年平均相對濕度84%，年平均降水量1 725～1 913 mm，壤土肥力中等，年平均無霜期214～252 d。

1.2?雷公藤甲素測定方法

1.2.1?色譜條件。

色譜柱為SinoChrom ODS-BP（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相為甲醇-水（體積比45∶55）;流速：1.0 mL/min;檢測波長：218 nm;柱溫：40 ℃;進樣量：20 μL。

1.2.2?對照品溶液的制備。

精密稱取24.80 mg雷公藤甲素標準品，置于50.00 mL容量瓶，用甲醇溶解并定容于刻度線，充分搖勻，配成每1 mL含0.496 mg的標準品儲備液。

1.2.3?供試品溶液的制備。

分別將采自5、7、9月的雷公藤根、莖、葉烘干、研磨、過篩（60目），各取2.00 g于三角瓶中，72 mL甲醇浸提12 h，過濾，蒸餾，加25 mL三氯甲烷萃取3次，旋轉蒸發儀蒸干，加少量洗脫液（甲醇∶乙酸乙酯∶乙醚=1∶2∶1）洗脫，超聲，溶解殘渣。加入中性氧化鋁于層析柱，待溶液經過層析柱，等量洗脫液洗脫2次，層析完畢，蒸干溶液，甲醇定容至10 mL，濾膜過濾，濾液作為供試品溶液備用。

1.2.4

陰性對照品溶液的制備。取按處方量除去雷公藤甲素制備樣品，并按“1.2.3”供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液。

2?方法學考察

2.1?專屬性考察

在檢測波長218 nm、柱溫40 ℃、進樣量20 μL、流動相為甲醇-水（45∶55）的高效液相色譜條件下，分

別精密吸取對照品溶液、陰性對照品溶液、供試品溶液各20 μL，按“1.2.1”色譜條件進行HPLC分析，結果表明（圖1～

3），陰性對照溶液在雷公藤甲素標準品色譜峰保留時間段

未出現色譜峰，表明陰性對照無干擾;且分離度達到10.17，理論塔板數不低于1 800，符合要求，表明此方法的專屬性較強。

2.2?線性關系考察

分別精密吸取標準品溶液0.031 25、0.062 50、0.125 00、1.250 00、2.500 00、5.000 00 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度，搖勻。

在“1.2.1”的色譜條件下，吸取各濃度的標準品溶液，分別進樣20 μL，測得峰面積，以溶液濃度（x）對峰面積（y）做線性回歸，得出線性回歸方程y=0.011 6 x+1.359 6（R2=0.999 7），說明雷公藤甲素濃度在1.55～248.00 μg/mL線性關系良好。

2.3?精密度試驗

吸取496 μg/mL雷公藤甲素對照品溶液20 μL，連續進樣5次，測定峰面積，計算雷公藤甲素峰面積的相對標準偏差RSD為1.04%，表明儀器精密度良好。

2.4?穩定性試驗

吸取“1.2.3”配制的雷公藤甲素供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、8、12、14、18、24 h分別測定一次，計算雷公藤甲素峰面積的RSD為0.96%，表明供試品溶液24 h內穩定性良好。

2.5?重復性試驗

取同時期制備的供試品溶液，重復進樣5次，測定峰面積，計算雷公藤甲素峰面積的RSD為0.96%，表明該方法重現性良好。

2.6?加樣回收率試驗

分別精確稱量雷公藤供試樣品2.00 g，平行6份，按相同質量濃度精確加入0.496 mg/mL雷公藤甲素對照品溶液，相同的方法測定峰面積，計算回收率，結果發現平均加樣回收率為99.6%，RSD為1.85%。

2.7?樣品測定

按“1.2.3”方法制得雷公藤不同部位的供試樣品溶液，再依“1.2.1”色譜條件進樣20 μL，計算含量，結果詳見表1。從表1可以看出，5、7、9月不同套種模式下雷公藤不同部位甲素含量從高到低依次為根、葉、莖。處理①、處理②、處理③、CK對照組3個月的甲素總含量分別為9.754 6、6.754 5、5.196 1、7.526 7 μg/mL，處理①的甲素含量最高，相比CK對照組高出29.61%，處理②和處理③的甲素含量較CK對照組分別降低10.26%、30.97%。同時還可看出，9月份4種處理的甲素含量均升高到最高，其中處理①的甲素含量極高（4.492 7 μg/mL），幾乎為處理②和處理③的2倍。雷公藤在5—9月進入生長期尤其是快速生長期，次生代謝較快，代謝產物甲素逐漸積累，于9月份甲素含量達到最高。

3?討論與結論

在200～450 nm處對雷公藤甲素進行測定，發現在218 nm處有最大吸收，因此選定218 nm為測定波長。選用甲醇-水（體積比45∶55）為流動相，能使雷公藤甲素與其他活性成分保持穩定的游離狀態，峰形對稱。通過對多次均衡進樣后的峰面積進行分析，發現進樣量為20 μL時，峰面積沒有明顯的變大或變小，較為穩定。

樣品溶液的出峰時間較對照品出峰時間推遲了約0.4 min，且出現了不同程度的雜質峰，原因可能是樣品溶液的制備過程中混有少量雜質，污染了色譜柱，使柱效降低，但對雷公藤甲素含量及出峰面積沒有影響。

試驗結果表明，不同套種模式下雷公藤甲素含量差異較大，相比雷公藤純林，厚樸林下套種的雷公藤甲素含量提高了29.61%，而杉木、馬尾松林下套種的雷公藤甲素含量則分別降低了10.26%、30.97%;根據樣品溶液的出峰現象，發現同種處理下，雷公藤根對應的峰最高、面積最大，葉次之，莖出峰面積最小，因此雷公藤不同部位甲素含量從高到低依次為根、葉、莖。孫乙銘等[16]測定了不同采收年限雷公藤不同部位的甲素含量發現根皮甲素含量最高、葉片次之，這與該研究的結果基本一致。涂育和等[17]測定了林下套種雷公藤的厚樸林的胸徑和樹高，發現其比厚樸純林分別高出了14.55%和7.43%。厚樸林下套種雷公藤，雷公藤的生長表現出了較高的優越性，然而厚樸也具有較高的藥用價值，多作為中藥制劑應用于臨床醫學，但現階段僅對套種模式中厚樸的形態特征有少量研究，雷公藤對厚樸的藥用成分是否有影響需進一步研究。

下雷公藤不同部位甲素含量

參考文獻

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