急性缺血性卒中患者血清miRNA-148a表達水平檢測及其臨床價值預探索

郭桂珍，韓榮勝，王有清，劉慶春

急性缺血性卒中（acute ischemic stroke，AIS）是神經內科最常見的危重癥之一，其致死率和致殘率均較高[1]。據統計數據顯示，我國每年新增卒中患者近200萬例，其中接近80%為缺血性卒中[2-3]。因此，進一步探討AIS可能的分子標志物顯得十分重要。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度為19～25 bp的小分子RNA，可在轉錄后水平對基因表達進行負調控，從而參與細胞增殖、分化、凋亡等多種生物學過程[4]。miRNA-148a定位于7號染色體7p15．2，與炎癥免疫性疾病和腫瘤的發生發展密切相關[5]。近期研究也發現，miRNA-148a可調節組織的缺血預適應損傷，并與創傷性腦損害的病理過程有關[6-7]。然而，關于miRNA-148a在AIS中的表達水平及臨床價值尚未見報道。本研究通過分析AIS患者外周血血清的miRNA-148a水平及臨床資料，以探討miRNA-148a在AIS發病和病情評估方面的潛在價值；同時，運用生物信息學方法預測miRNA-148a可能的調節機制，為后續研究提供理論基礎。

1 研究對象與方法

1．1 研究對象 本研究為前瞻性研究，選取2017年10月-2018年4月青海省第五人民醫院神經內科收治的AIS患者42例為觀察組，其中男性25例，女性17例，平均年齡62．4±9．3歲。納入標準：①年齡40～85歲，首次發病且發病至入院時間＜12 h；②AIS的診斷符合2014年中國急性缺血性卒中診治指南[3]。排除標準：①合并出血性卒中、顱內血管畸形等神經系統疾??；②合并心絞痛、心肌梗死、感染、炎癥免疫性疾病、惡性腫瘤、血液病等；③嚴重心力衰竭、嚴重肝腎功能不全者；④近期口服免疫抑制劑、糖皮質激素或細胞毒性藥物。選取于本院體檢中心接受體檢且確定無全身疾病者42例為健康對照組，根據年齡和性別與觀察組進行1∶1匹配。本研究經醫院倫理委員會批準，所有研究對象均知情同意。

1．2 資料收集 收集年齡、性別、高血壓史、糖尿病史、吸煙史等基本臨床資料，記錄AIS患者發病至入院的時間，并根據顱內MRI結果計算梗死灶最大層面直徑。其中，直徑＜1．5 cm為腔隙性腦梗死，1．5～5．0 cm為中等面積腦梗死，＞5．0 cm為大面積腦梗死[8]。收集患者生化指標檢測結果，包括LDL-C、HDL-C、入院血糖、Cr、hs-CRP等。

所有研究對象至醫院后即刻抽取其肘靜脈血5 mL于非抗凝管中，3000 g×15 min離心，取上清液分裝于離心管中并儲存于-80 ℃冰箱，以便統一檢測miRNA-148a水平。采用Trizol裂解液提取血清樣本的總RNA，RNA反轉錄合成cDNA。然后以cDNA為模板采用實時定量聚合酶鏈反應技術進行基因片段擴增，儀器為Bio-Rad iQ5實時熒光定量聚合酶鏈反應儀。其中，miRNA-148a的上游引物序列為5'-TCAGTGCACTACAGAACTTTGT-3'，下游引物序列為5'-GCTGTCAACGATACGCT ACGT-3'。U6核小分子RNA作為內參基因，其上游引物序列為5'-CGCTTCGGCAGCACAT ATA-3'，下游引物序列為5'-TTCACGAAT TTGCGTGTCAT-3'。反應條件為：95 ℃預變性30 s，40個循環（95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s）。miRNA-148a的相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。

1．3 公共數據分析 從基因表達綜合數據庫（Gene Expression Omnibus，GEO）（https：// www．ncbi．nlm．nih．gov/geo）下載數據集GSE55937[9]。該數據集共收集24例AIS患者和24例健康對照者的外周血樣本，采用Affymetrix公司的Multispecies miRNA-3 Array芯片進行檢測，平臺號為GPL16384。下載數據為CEL格式，采用R軟件的affy包進行背景校正、數據標準化和log2轉換后用于后續分析。

1．4 生物信息學分析 采用miRDB、miRTar Base和TargetScan數據庫分別對miRNA-148a的靶基因進行預測，其結果取交集后得到最終的靶基因。采用Cytoscape 3．6．0軟件構建miRNA-148a的靶基因調控網絡。然后，利用DAVID 6．8在線工具對靶基因進行富集分析，包括基因本體論（gene ontology，GO）-生物學過程、京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號通路，其結果用超幾何分布進行統計學檢測。

1．5 統計學方法 采用GraphPad 6．0軟件進行統計學分析。采用Kolmogorov-Smirnov法進行正態檢測，所有計量資料均符合正態分布，用表示，其組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數資料用頻數（%）表示，其組間比較采用χ2檢驗。采用Spearman相關性檢驗分析miRNA-148a水平與AIS患者臨床資料之間的關系。繪制miRNA-148a對AIS診斷的受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，以曲線下面積反映其診斷效能。P＜0．05為差異具有統計學意義。

2 結果

2．1 miRNA-148a在急性缺血性卒中患者中的表達 AIS組患者入院時的血清miRNA-148a相對表達量為0．76±0．23，而健康對照組的miRNA-148a相對表達量為1．02±0．21，差異具有統計學意義（t=5．392，P＜0．001）。ROC曲線分析提示，miRNA-148a診斷AIS的曲線下面積為0．79（95%CI0．70～0．89，P＜0．001）（圖1）。

2．2 miRNA-148a與急性缺血性卒中患者臨床資料的相關性 根據AIS患者miRNA-148a相對表達量的中位數將其分為低水平組（＜0．74，n=21）和高水平組（≥0．74，n=21），結果表明兩組患者的腦梗死面積、HDL-C和hs-CRP水平存在顯著差異（表1）。Spearman相關性分析提示AIS患者的miRNA-148a水平與腦梗死面積（r=-0．34，P=0．03）和hs-CRP（r=-0．43，P=0．005）均負相關，而與其他臨床資料無關。

2．3 GSE55937數據集中miRNA-148a的表達在公共數據集G SE55937中，A IS患者的miRNA-148a相對表達量為1．93±0．46，而對照組的miRNA-148a相對表達量為2．52±1．00，差異具有統計學意義（t=2．64，P=0．011）。ROC曲線分析表明，miRNA-148a診斷AIS的曲線下面積為0．69（95%CI0．54～0．84，P=0．022）（圖2）。

2．4 生物信息學分析 miRDB、miRTarBase和TargetScan 三個數據庫同時預測到58個miRNA-148a的靶基因，包括WNT10B、DNMT1等（圖3）。GO和KEGG富集分析提示，這些靶基因主要涉及的生物學過程包括細胞凋亡的正向調控、神經元分化以及凋亡相關的線粒體膜蛋白插入的正向調控等，主要涉及的信號通路包括叉頭框轉錄因子O亞族信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路、轉化生長因子-β信號通路等（表2）。

表1 不同miRNA-148a水平組急性缺血性卒中患者的臨床資料比較

圖2 GSE55937數據集中miRNA-148a的表達情況（左）及其診斷急性缺血性卒中的受試者工作曲線（右）

圖3 miRNA-148a的靶基因預測（左）及其調控網絡（右）

3 討論

目前，AIS的發病率在我國乃至世界范圍內仍居高不下，嚴重威脅人類健康并加重社會負擔。因此，尋找AIS有效的生物標志物有重要臨床意義。外周血miRNA相對穩定、不易降解且其檢測方法較為敏感、準確，可作為臨床疾病潛在診斷和病情鑒別的新型標志物[10]。既往研究提示，miRNA在神經系統發育和功能上起到重要作用[11]。miRNA與神經系統疾病的關系也是近年來的熱點研究問題，而腦血管疾病患者的外周血miRNA也存在不同程度的差異表達。例如，Lili Zeng等[12]的研究發現AIS患者外周血的miRNA-210表達水平較對照組顯著下降，尤其在發病后第7天和第14天更為明顯，可能是診斷AIS的潛在標志物之一。而Jingru Wang等[13]近期的研究提示，miRNA-148/152家族的另一成員miRNA-148b可通過影響Wnt信號通路蛋白，從而參與AIS后的腦組織修復過程。本研究通過分析AIS患者的臨床數據和公共數據庫數據，均發現miRNA-148a在AIS患者中水平降低，且在一定程度上可反映腦梗死嚴重程度和炎癥水平。

表2 miRNA-148a靶基因的富集分析

通過生物信息學分析，本研究共預測到58個miRNA-148a的靶基因，包括WEN10B、DNMT1等。有研究表明，miRNA-148a可通過與WEN10B直接結合，進而抑制Wnt/β-catenin通路[14]。而DNMT1是miRNA-148a的重要的靶基因[15]。抑制DNMT1則有助于保護腦缺血性損傷[16]。以上這些靶基因主要涉及細胞凋亡、FoxO信號通路、PI3K-Akt通路等分子機制。近年來的觀點認為，腦缺血核心區以壞死為主，而缺血程度較輕的半暗帶則以凋亡性死亡為主，因此細胞凋亡也是腦缺血造成神經系統損傷的重要機制[17]。FoxO信號通路參與調控細胞抗氧化應激、DNA修復和凋亡等過程[18]。Deyuan Li等[19]研究表明，FoxO信號通路蛋白FOXO3a與腦缺血缺氧模型大鼠的神經細胞凋亡有關，而PI3K-Akt通路則是調節AIS信號轉導的重要機制之一，應用PI3K抑制劑LY294002可降低磷酸化的Akt水平，增加腦梗死體積[20]。因此，miRNA-148a可能通過調控WEN10B、DNMT1等靶基因，影響細胞凋亡和FoxO、PI3K-Akt等信號通路，從而參與AIS的發生發展。

在GEO數據庫的GSE55937數據集中，AIS組miRNA-148a的表達水平也明顯低于對照組，且miRNA-148a對AIS具有一定的診斷效能，表明本研究的結論相對穩定。此外，本研究利用多個miRNA數據庫對miRNA-148a的靶基因進行預測，其預測的結果也相對可靠。但本研究仍有以下不足：①臨床數據的樣本較小且為單中心研究，因此可能導致結果有一定的偏倚；②所采集的樣本均為外周血血清樣本，不能明確腦組織中miRNA-148a的表達情況，但如前所述，外周血miRNA相對穩定，其檢測方法較為敏感準確；③因本研究重點關注miRNA-148a在AIS早期的變化，故未對其進行連續監測，不能明確AIS患者發病后miRNA-148a的動態水平。

綜上所述，A IS患者發病早期的血清miRNA-148a降低，在一定程度上可反映腦梗死程度和炎癥水平，可能涉及細胞凋亡和FoxO、PI3K-Akt等信號通路。因此，miRNA-148a可能在AIS的診斷及病情評估方面具有一定參考價值。