復發性流產患者血栓前狀態分析及其與MTHFR 基因C677T 位點多態性的相關性研究

宋金龍 陳萍萍 王鵬鯤 賴毛華 馬紅霞 李 娟

1.廣州醫科大學附屬第一醫院檢驗科，廣東廣州 510120；2.廣州醫科大學附屬第一醫院中醫科，廣東廣州 510120

復發性流產（recurrent spontaneous abortion，RSA），一般是指與同一配偶連續發生3 次或以上的自然流產，在妊娠女性中發生率為1%～5%[1-2]。也有國外和部分中國學者將連續2 次及以上妊娠物或胎兒丟失定義為RSA[3]。RSA 病因主要包括染色體異常、女性生殖道解剖結構異常、凝血功能異常、內分泌失調、免疫因素、感染因素以及男性因素等，臨床上仍有30%～40%的患者流產原因未明確[4]。有研究顯示[5]，50%～65% RSA 婦女中至少存有一種遺傳性或獲得性血液高凝狀態，而這種血液高凝狀態又稱為血栓前狀態（pre-thrombotic state，PTS）。RSA 與母體內凝血功能異常的相關性仍沒有受到足夠的重視，且RSA 患者沒有明顯的臨床表現，其診斷較為困難，血栓前狀態的診斷標準正處于探索階段。此外，國內外對于亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR） 基因C677T 位點突變與RSA 相關性結論仍存在爭議。因此，本研究主要從PTS 及MTHFR 基因C677T 位點突變兩方面進行研究，探討其與RSA 的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018 年9 月—2019 年3 月于廣州醫科大學附屬第一醫院（以下簡稱“我院”）就診的77 例RSA患者作為RSA 組，年齡21～40 歲。納入標準：經診斷確診為RSA，28 周以前發生流產史連續3 次或以上。排除標準：①經過系統流產的病因篩查，排除自然流產明確病因，包括夫婦染色體異常、解剖異常、內分泌異常、感染以及抗磷脂綜合征；②排除靜脈栓塞病史；③排除急、慢性肝臟及腎臟疾病，全身惡性腫瘤，自身免疫性疾病。選擇同期在我院進行孕前檢查的健康女性41 名作為正常對照組，年齡23～40 歲。納入標準：具有正常生育史的健康婦女。排除標準：有任何原因導致的流產史。本研究經我院醫學倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 觀察指標及樣本采集 統計兩組凝血酶原時間（prothrombin time，PT）、凝血酶時間（thrombin time，TT）、纖維蛋白原（fibrinogen，FIB）、活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）、抗凝血酶-Ⅲ（antithrombin-Ⅲ，AT-Ⅲ）、蛋白C（protein C，PC）、蛋白S（protein S，PS）缺陷發生率等指標，并比較兩組MTHFR 基因C677T 位點的基因多態性。AT-Ⅲ活性參考值：80～120，＜80 為AT-Ⅲ缺陷；PC 活性參考值：70～130，＜70 為PC 缺陷；PS 活性參考值：55～140，＜55 為PS 缺陷。采用靜脈穿刺抽取法抽取5 mL，全血樣本2 mL，凝血管3 mL。凝血管抽取后30 min 內，經3000 r/min 離心15 min，上儀器檢測凝血4 項；剩余血漿標本放入-80℃冰箱儲存，3 個月內進行易栓癥3 項檢測；全血標本1 個星期內進行血液基因組提取。

1.2.2 主要試劑與儀器 血液基因組提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，貨號：DP349]；Premix ExTaq酶體系（大連寶生物工程有限公司，貨號：RR320A）；標準分子量Marker DL2000（天根生物科技有限公司，貨號：MD114）；PS 活性測定試劑盒（法國思達高公司，貨號：00746）；PC 活性測定試劑盒（法國思達高公司，貨號：00671）；AT-Ⅲ活性檢測試劑盒（法國思達高公司，貨號：00672）。全自動立式凝血分析儀（法國思達高公司，STA-R Max）；聚合酶鏈反應（PCR）儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司，ABI9700 型）；微量紫外分光光度儀（賽默飛世爾科技公司，NanoDrop2000）；電泳儀和BioRAD 凝膠成像系統（美國伯樂生命醫學產品有限公司，SYSTEM GelDoc XR+）。

1.2.3 血液基因組DNA 的提取以及濃度測定 依照血液基因組提取試劑盒的說明書進行DNA 提取，采用Nano Drop 2000 微量紫外分光光度儀對DNA 質量及濃度進行檢測，用提取盒中洗脫液進行調零，吸取提取好的核酸2 μL 進行濃度和純度測定。

1.2.4 MTHFR 基因片段擴增以及瓊脂糖凝膠電泳 引物參考文獻[6]，由生工生物工程股份有限公司合成，PCR 反應體系為20 μL：Premix ExTaq Mix 為10 μL，引物各為1 μL（10 pmol/μL），DNA 模板為2 μL，補充去離子水至20 μL；PCR 反應條件：95℃預變性5 min；95℃45 s，60℃30 s，72℃45 s，共進行32 個循環；72℃延伸5 min；配置3%瓊脂糖，PCR 產物5 μL 與1 μL 6×Loading buffer 混勻后點樣，設置電泳參數，電壓110 V，電流300 mA，時間30 min；生工生物工程股份有限公司將對含有目的條帶的PCR 產物進行測序。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件對所得數據進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用兩獨立樣本t 檢驗；非正態分布的計量資料以中位數和四分位數[M（P25，P75）]表示，采用秩和檢驗；計數資料以例數或百分比表示，采用χ2檢驗。以ROC 曲線方法判斷易栓癥在RSA 發生時AT-Ⅲ、PC、PS 活性的最佳臨界值。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組人群一般資料比較

兩組人群年齡、體重、血壓和血紅蛋白比較，差異無統計學意義（P ＞0.05），具有可比性。見表1。

2.2 兩組人群PT、FIB、APTT、TT 水平比較

兩組人群PT、APTT、TT 水平比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。RSA 組FIB 水平高于正常對照組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表2。

2.3 兩組人群AT-Ⅲ、PC 和PS 缺陷發生率比較

兩組人群AT-Ⅲ、PC 缺陷率比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。RSA 組PS 缺陷發生率高于正常對照組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表3。

表1 兩組一般資料比較[M（P25，P75）]

表2 兩組人群PT、FIB、APTT、TT 水平比較

表3 兩組人群AT-Ⅲ、PC 和PS 缺陷發生率比較[例（%）]

2.4 易栓癥三項AT-III、PC、PS 診斷RSA 的ROC 曲線

僅PS 指標具有篩查意義（P ＜0.01），以PS 判斷RSA 患者存在PTS 的最佳臨界值為45%，曲線下面積為0.701（95%CI：0.611～0.791，P<0.01），靈敏度為95.1%，特異度為42.9%。見圖1。

圖1 易栓癥三項AT-Ⅲ、PC、PS 診斷RSA 的ROC 曲線

2.5 MTHFR 基因PCR 擴增電泳

RSA 組與正常對照組MTHFR 基因經PCR 反應后都能擴增出目的基因條帶，長度為198 bp，以其中15 個標本電泳結果為例。見圖2。

2.6 MTHFR 基因C677T 位點基因型和等位基因頻率分布比較

經Hardy-Wenberg 遺傳平衡定律檢驗，所有基因型在兩組中均符合遺傳平衡，具有群體代表性。兩組人群中基因型比較，差異有統計學意義（P ＜0.05）。兩組人群等位基因頻率比較，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表4。

圖2 MTHFR 基因PCR 擴增電泳

表4 MTHFR 基因C677T 位點基因型和等位基因頻率分布比較[例（%）]

3 討論

RSA 的原因非常復雜，在孕婦妊娠的過程中，胚胎生長發育環境的平衡一旦遭到破壞，就可能會導致流產等不良的妊娠結局[3]。已有的臨床研究發現許多有不良妊娠結局的婦女都存在血栓形成的傾向，包括胎兒生長受限、妊娠高血壓、稽留流產、胎盤早剝以及不明原因的RSA 等。這種因血液持續高凝狀態以致血栓形成的風險增加稱為易栓癥，也稱為PTS[7]。

作為PTS 的一種獨立危險形成因素，高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia，Hhcy）可損傷血管內皮細胞，形成胎盤部位或者子宮螺旋動脈血栓，從而導致胎兒的供血不足，甚至可導致流產[8]。Hhcy 為血管粥樣硬化和動靜脈血栓疾病常見的強烈的高危因素[9]，遺傳性Hhcy 主要由MTHFR 基因突變導致。在DNA 甲基化過程中，MTHFR 作為調節半胱氨酸和四氫葉酸代謝的關鍵酶也起到了關鍵的作用，該基因位于染色體1p36.3 的位置，全長19.3 kb，mRNA 全長7105 bp，共有12 個外顯子，為常染色體顯性遺傳[10]，該基因的突變可能會引起不良妊娠結局[11-12]。

FIB 是血栓形成的重要參與成分[13-14]，為一種由肝臟合成的具有凝血功能的蛋白質，其作為血漿黏滯度的主要決定因素，在血小板的聚集過程中起重要作用。RSA 患者血小板和凝血功能較正常妊娠明顯增強[15]，本研究中RSA 組FIB 高于正常對照組，提示RSA 組相對于正常對照組而言，更容易形成高凝易栓狀態。

PTS 是指抗凝蛋白、凝血因子、纖溶蛋白等的遺傳性或獲得性缺陷[16]，包括PC 缺乏癥、PS 缺乏癥、抗凝血酶缺乏癥等[17]。主要標志物包括AT-Ⅲ、PC 和PS，其中PS 是PC 的輔助因子[18]，PS 是維生素K 依賴性單鏈糖蛋白，主要在肝臟中合成[19]。隨著凝血因子增加、抗凝血成分減少以及纖溶活性降低，在妊娠晚期孕婦會出現生理性的易栓狀態，雖然這將有利于孕婦在生產后高效率、快速止血，但同時產婦患PTS 的可能性也大大增加[20-21]。本研究中RSA 組PS 缺陷率高于正常對照組，且僅PS 活性指標有篩查意義，提示PS 活性可以作為PTS 引起RSA 發生的篩查指標。兩組PC 的缺陷發生率無明顯區別，提示PC 缺陷者在RSA 患者中并不多見，可能是本研究樣本量有限，但也有可能提示PC 缺陷與RSA 相關性并不高，這需要繼續加大樣本量進一步探討和驗證。

MTHFR 參與了葉酸的轉運和代謝[22-23]，而某些基因位點（677 位點C→T）可引起MTHFR 酶活性的降低，引起葉酸代謝異常，使葉酸水平降低及Hhcy 的形成，從而增加了血液高凝易栓的風險，造成不良妊娠結局。677 位點C 突變為T 的孕婦會增加RSA 的風險[24-25]，還可能與C 基因位點可能對Hhcy 水平有抑制作用，而T 基因位點有促進Hhcy 水平增高的作用有關。本研究結果顯示RSA 組CT、TT 基因型分布頻率均高于正常對照組，且RSA 組T 等位基因分布頻率高于正常對照組，證實了MTHFR C677T 基因突變與RSA 的發病具有一定相關性。

綜上，本研究初步證實了PTS 與RSA 的發生存在明顯的相關性，是引起流產的重要因素之一。同時證明了RSA 與MTHFR 基因C677T 位點多態性有一定的相關性，但是本研究存在樣品量不足以及未檢測葉酸和Hhcy 水平等問題。在臨床實踐中應重視RSA 患者的PTS 評估，有利于在孕前發現遺傳性RSA患者，從而開始早期抗凝治療，改善妊娠結局以及并發癥。