基于GC-MS 的2 型糖尿病血漿代謝組學研究

王佳娜 薛 傲 張 悅 王 巖 姚 遠 張 寧 劉 斌

1.黑龍江中醫藥大學佳木斯學院，黑龍江佳木斯 154007；2.黑龍江中醫藥大學藥學院，黑龍江哈爾濱 150040

2 型糖尿病（T2DM）是一種常見的內分泌類代謝性病癥，主要臨床特征為慢性高血糖、胰島素分泌不足等，其通常表現為整體性的代謝紊亂[1-2]。繼發于糖尿病的心血管疾病是最嚴重的并發癥之一[3]，現有研究普遍認為T2DM 是多種危險因素共同作用形成的。代謝組學[4-6]是通過對生物體內所有的代謝物進行定量分析，來尋找代謝物與生理病理變化的相對關系一門學科。氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）[7-10]是目前研究中最常用的一種代謝組學研究技術，是集色譜法的高分離能力和質譜法的結構鑒定準確能力于一體的分析方法，可檢測大量小分子代謝物，并具有受機體效應影響小的特點，為代謝組學在復雜化合物研究提供了一種高效的定性和定量工具。

1 對象與方法

1.1 儀器

6890N-5975B 氣質聯用儀（美國安捷倫公司）；DB-5MS 柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；十萬分之一天平（德國賽多利斯公司）；KQ5200 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；渦旋混合器（金壇市醫療儀器廠）；TGL-16G-C 高速臺式冷凍離心機（離心機半徑5.9 cm，上海安亭科學儀器廠）；DZF-6020 真空干燥箱（上海齊欣科學儀器有限公司）；Thermo Scientific Forma 702 超低溫冰箱（Thermo）；HGC-12A 氮吹儀（天津恒奧科技發展有限公司）。

1.2 試劑

乙腈（Honeywell Burdick &Jackson，DF658）；吡啶（天津市科密歐化學試劑有限公司，20120206）；甲氧胺鹽酸鹽（LR10O40）、N-甲基-三甲基硅烷基-三氟乙酰胺（MSTFA，LS70O107）購于北京百靈威科技有限公司；三甲基一氯硅烷（TMCS，ACROS ORGANICS，A0330141）；二十二烷（東京化工業株式會社，F14S034）；氦氣純度為99.999%（哈爾濱卿華工業氣體有限公司）。

1.3 樣品

實驗中所使用的人體血漿樣本均取得本人同意后，清晨（即空腹8 h 以上）采集肘部靜脈血，樣本均由黑龍江省佳木斯市中心醫院腎內科于2018 年6—7 月收集，健康組（60 名）為正常人血漿樣本，T2DM組（100 例）為T2DM 患者血漿樣本。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

二十二烷正庚烷溶液（內標準液）：取0.005 g 二十二烷，置入50 mL 容量瓶中，用正庚烷定容至刻度，搖勻，備用；甲氧胺吡啶溶液：稱取0.15 g 甲氧胺鹽酸鹽，置入10 mL 容量瓶中，用吡啶溶液定容至刻度，搖勻，備用；硅烷化衍生化試劑：分別取MSTFA 溶液10 mL，TMCS 溶液100 μL 混合均勻，備用。

樣品在4℃冰水上解凍30～60 min，取100 μL 樣品至離心管中，加入400 μL 萃取溶劑渦旋混合15 s，-20℃下放置10 min，在4℃、10 000 r/min 離心10 min，取400 μL 上清液轉移至2 mL 離心管內，氮吹后，將其加入100 μL 甲氧胺吡啶溶液，加入100 μL 衍生化試劑，并加入100 μL 內標準液，常溫3000 r/min 離心10 min，取上清液至離心管中，待GC-MS 分析。

2.2 GC-MS 條件

色譜柱DB-5MS 柱；進樣口溫度270℃；分流比10∶1；流速：1.0 mL/min；載氣：He（99.999%）；進樣量1 μL；溶劑延遲3 min。采用正離子模式，四級桿溫度為150℃；電離方式：EI；離子源溫度：230℃；電子能量70 eV；質量范圍m/z 30～600；掃描間隔0.2 s；電子倍增電壓0.9 kV。升溫 程序：0～3 min，90～220℃；3～32.5 min，220～280℃；后運行溫度280℃；后運行時間5 min。

2.3 統計學方法

采用SPSS 18.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2.4 精密度

取同一供試品溶液，連續進樣6 次，色譜峰個數和主要共有峰相對面積的RSD 均小于5%，提示儀器精密度良好。

2.5 重現性

取樣品平行制備6 份供試品溶液，比較色譜峰個數及主要共有色譜峰的相對峰面積，得RSD 值均小于5%，提示供試品溶液制備方法重復性良好。

2.6 穩定性

2.6.1 日內穩定性 樣品按“2.1”項下方法處理后放置于4℃冰箱內，在0、2、4、6、8、10 h 分別進樣，比較6 次進樣后色譜峰的個數和主要共有峰的相對峰面積，得RSD 值均小于5%，提示供試品穩定性良好。

2.6.2 凍融穩定性 -80℃冷凍樣品融化后，取400 μL至離心管后，立即將樣品放回-80℃冰箱中，至完全冷凍后再取出，融化，取100 μL 至離心管中，按上述方法重復4 次后，制備所有取出樣品，按“2.1”項下方法制備，分別比較樣品峰的個數和共有峰相對峰面積，得RSD 值均小于5%，說明樣品具有很好的穩定性。

2.7 血漿樣品代謝譜建立

按“2.1”項下分析得到健康組和T2DM 組的血漿樣品GC-MS 圖，見圖1。由于實驗樣本較多，為減少實驗樣本批次之間保留時間的漂移、色譜圖背景不一致等影響，采用自動質譜去卷積鑒定系統、NIST05a質譜庫、MZ-mine 等進行分析。共鑒定化合物37 種。

2.8 血漿樣品代謝譜主成分分析（PCA）

T2DM 組和健康組血漿樣品代謝譜的PCA 圖，見圖2。PCA 圖直觀反映了兩組間存在代謝模式的差異。

圖1 血漿樣品GC-MS 總離子流圖

2.9 血漿樣品偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）模型

通過PCA 分析結果可以看出，兩組的血漿樣品存在顯著差異，為進一步區分這兩類群體，建立了具有更準確預測能力的PLS-DA 判別模型。見圖3。

2.10 潛在生物標志物的確定

圖2 血漿樣品代謝譜的PCA 圖

圖3 血漿代謝譜的PLS-DA 圖

通過對圖3 的觀察，可知健康組和T2DM 組的代謝圖譜類似，只是在含量上有所不同。因此，引用SIMCAP 11.5 對數據進一步處理，采用PLS-DA 載荷矩陣圖（見圖4）對兩組進行識別結合血漿供試品VIP圖結合S 圖（見圖5），選取對分類貢獻較大的變量。通過以上分析篩選，最終得到血漿樣品的10 個差異代謝物（見表1），并對健康組和T2DM 組間進行t 檢驗分析（見表2），得到P <0.05 的潛在生物標志物確定為內源性生物標志物。

圖4 血漿供試品PLS-DA 圖

圖5 血漿供試品VIP 圖結合S 圖

表1 生物標志物信息表

3 討論

萃取溶劑主要對乙腈、甲醇用于樣品代謝譜的影響做對比研究。結果顯示色譜峰濾噪前乙腈處理的色譜峰個數及峰面積均低于甲醇，濾噪后結果相差不大。綜上，本實驗選用甲醇作為萃取劑。

對樣品肟化條件進行研究，發現70℃反應1 h 所得的代謝物峰的個數及峰面積優于70℃反應0.5 h，而37℃反應12 h 與70℃反應1 h 結果相差不大。綜上，肟化條件為70℃反應1 h。

衍生化條件發現，60℃反應1 h 的峰面積部分低于60℃反應2 h 和37℃反應12 h，37℃反應12 h 部分峰面積高于60℃反應2 h，可能是由于37℃反應12 h時間過久致部分樣品揮發濃度增高，綜上衍生化條件為60℃反應2 h。

本研究建立了基于GC-MS 的T2DM 血漿代謝組學分析方法[11-12]，其中包括供試品溶液的制備方法，血漿代謝圖譜的建立和內源性代謝物的鑒定。通過衍生化方法最大限度的采集到代謝信息。通過多元統計分析方法并結合NIST05a 標準質譜庫進行檢索，對血漿中的代謝物進行了定性、定量分析，成功鑒定出血漿內源性代謝物。其中L-丙氨酸、L-纈氨酸、L-異亮氨酸、檸檬酸、酪氨酸呈下降趨勢；乳酸、亞油酸、棕櫚酸、油酸和硬脂酸呈上升趨勢。經過文獻查閱發現，這些代謝產物主要與氨基酸代謝、糖脂代謝和能量代謝等途徑相關[13-15]。文獻顯示[16-20]，T2DM 患者的糖脂代謝、氨基酸代謝等多種代謝途徑均發生了不同程度的紊亂。本實驗為后續T2DM 研究提供基礎。

表2 兩組血漿樣品標志物水平比較