高效富集肺癌及癌旁組織轉錄因子的技術-catTFRE

謝輝 陳振崗 史學軍 鄧增華 孫長青 王輝 李一鳴 秦鈞 王廣舜

肺癌作為一種發(fā)病率和死亡高居世界第二，在中國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，已經嚴重影響到人類的生命健康[1-2]。中國國家癌癥中心數據顯示，2014年全國惡性腫瘤估計新發(fā)病例380.4萬，死亡病例229.6萬例，其中肺癌每年發(fā)病約78.1萬，死亡病例62.6萬例，均位居全國首位[3]。2000-2014年全球癌癥生存率變化趨勢監(jiān)測研究報告(CONCORD-3)顯示，中國肺癌的發(fā)病占所有癌癥的22.6%，而5年生存率僅19.8%[4]。雖然針對肺癌的研究一直在持續(xù)進行，但進展很難令人滿意。繼靶向治療后，隨著CAR-T[5-6]細胞治療及PD1/PD-L1抑制劑[7-8]的橫空出世，免疫治療極大的改變了癌癥科研和治療的理念，為肺癌的治療帶來了新的革命性進展，但免疫治療尚處于高速發(fā)展階段，很多技術環(huán)節(jié)仍有待細化與改進，有效率較低(約20%)、優(yōu)勢人群還不很明確、免疫相關不良事件(immune-related adverse events, irAE)等[9-10]問題仍需要進一步全面認識。近期由吳一龍教授牽頭的全國多中心隨機對照Ⅱ期臨床研究[11]：新輔助靶向治療對比化療的頭對頭研究(CTONG1103)結果發(fā)表在J Clin Oncol雜志上，研究顯示術前應用靶向藥物(厄洛替尼)，有效率高于化療約20%，手術成功率提高約15%，并且降低了術后復發(fā)風險，中位無進展生存期(median progression-free survival, mPFS)提高了10個月，首次證實了EGFR-TKI在新輔助及輔助階段的應用，但總體而言，如客觀緩解率(objective response rate, ORR)等獲益并未達到預期。新的方向的研究仍迫在眉睫。

轉錄因子(transcription factor,TF)作為與DNA特異性結合并調控轉錄功能的蛋白質家族，幾乎所有的生物過程，都是由轉錄調節(jié)系統(tǒng)調控的[12]。多種疾病的發(fā)生就是源于一個調控體系的失調，研究發(fā)現[13]164個TF直接與277種疾病或癥狀相關聯。許多TF在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的過程中就起到關鍵作用，如轉錄因子EGFR，KRAS，HER2等。所以，基于目前肺癌的高發(fā)病率、高死亡率及TF在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中所起關鍵作用，在轉錄水平上研究肺癌組織與癌旁組織中TF的差異表達，可能對肺癌發(fā)病機制、早期診斷、轉移及治療有重要的指導意義。

鑒于TF作為核提取物(nuclear extract, NE)，其低豐度性[14]，將其從高豐度的蛋白質中大規(guī)模鑒定出來一直是個難題。我們研發(fā)了基于蛋白質組學技術的可以有效富集低豐度TF的檢測技術——catTFRE(a concatenated tandem array of the consensus transcription factor response elements，TF富集技術)[14]，可以從細胞中大規(guī)模鑒定內源性TF。但其在肺癌組織水平上對TF的富集效率如何還不得而知，本文首次利用catTFRE技術對肺癌及癌旁組織的TF進行富集，并初步探討其調控的生物過程。

資料與方法

一、標本和取材

來自天津醫(yī)科大學寶坻臨床學院腫瘤科病理證實的肺癌組織及癌旁組織6例。受試者均被告知組織標本用于研究目的，知情同意。

二、生物素標記的DNA(Biotin-DNA)的獲得

1 DNA 反應元件的設計

根據已知高等脊椎動物的轉錄因子結合譜(http://jaspar.genereg.net/, The high-quality transcriptionfactor binding profile database)，人工合成串聯的結合序列，并將其構入載體 pGEX4T2中。

2 體外擴增DNA序列

通過人工合成生物素(biotin)標記的聚合酶鏈式反應(PCR)引物，以構建好的pGEX4T2-catTFRE為模板，經PCR來擴增目的產物片段。

3 瓊脂糖凝膠電泳及DNA回收

按照Gel Extraction Kit(快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒)的說明書進行，得到Biotin-DNA。

三、組織樣本核蛋白的制備

肺癌組織及癌旁組織核提取物(NE)的提取按照從Thermo Scientific公司購買的“NE-PER?Nuclearand Cytoplasmic Extraction Reagents”試劑盒上的說明書進行提取。提取完成之后用Bradford法[15]測定核蛋白的濃度。

四、轉錄因子的富集

使用catTFRE方法對組織樣本的TF進行富集。每組樣品用3pmol(6μg)Biotin-DNA與120μL Dynal M280 鏈霉親和素磁珠結合后，再與600μg的組織核提取物結合，得到的protein-DNA復合物，然后洗去磁珠上非特異結合的蛋白，經過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對富集的樣品進行預分離，進行膠內酶解、肽段萃取，并將每組樣品合并為3個組份，經60 ℃真空抽干，進行質譜分析及鑒定。

五、生物信息學分析

應用基于強度的絕對定量方法(iBAQ)，依據組間 iBAQ值之間的比值對蛋白的表達量變化進行評定[16]。對于鑒定到的發(fā)生變化的TF及蛋白，通過KEGG _Pathway Analysis進行生物信息學分析。當Student t-檢驗P<0.05 時，認為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、catTFRE可高效富集肺癌及癌旁組織的轉錄因子

研究報道[13]TF的表達數量在組織類型之間變化很大，范圍從闌尾、皮膚約150種，到全腦、甲狀腺超過300種，其中肺的TF約270種。然而，所有表達基因相關的TF在所有樣本表達基因中的比例穩(wěn)定在6%左右[13,17]。由于富集的TF復合體以及相關蛋白的復雜程度較高，為提高TF的鑒定水平，我們通過傳統(tǒng)的SDS-PAGE，在蛋白水平對富集樣品進行預分離，經膠內酶解和肽段萃取后為分3個組分進行質譜鑒定。質譜鑒定結果如下：肺癌組的質譜掃描譜圖的平均利用率>50%，通過數據庫搜索，得到高可信度肽段數7369～10423，平均高可信度肽段數9916；鑒定到蛋白數為1256～1689，平均蛋白數1431種 (特異性肽段數量≥1)，含有轉錄因子193～264種，平均223種；癌旁組中，得到高可信度肽段數6984～9843，平均高可信度肽段數8756；鑒定到蛋白數為1236～1590，平均蛋白數1383種 (特異性肽段數量≥1)，含有轉錄因子182～207種，平均191種TF(見表1)。所富集到的TF包含了bZIP(Basic Leucine Zipper family)、ETS(E-twenty six)、HMG-box (High Mobility Group box family)、HLH(basic helix-loop-helix family)、FOX(Forkhead box family)、HOMEO(Homeobox family)、NHR(Nuclear hormone receptors family)、ZNF(Zinc finger family)以及p53 等各家族的TF。

表1 肺癌組織及癌旁組織轉錄因子鑒定對比

我們既往通過catTFRE對人類的HeLa、MCF-7及小鼠的Miliver等11個細胞系的TF進行富集，每個細胞系在肽段萃取后分為12個組分，質譜鑒定時間為16小時。檢測到單個細胞系的TF從207到460 種，平均290種[14]。同時，為了提高效率及節(jié)約經濟成本，本研究中組織樣品經肽段萃取后僅分為3個組分，質譜鑒定時間縮短為6小時，鑒定的TF基本上就可以達到細胞水平。此外，由于TF在細胞內的表達豐度極低(僅占細胞總蛋白的0.001%～0.01% )[14]，而本研究中每組鑒定到的TF的總量(iBAQ)值約占每組鑒定到的蛋白總量的10%以上。說明catTFRE確實可以對癌及癌旁組織中的TF進行有效富集。

二、差異表達蛋白及差異表達轉錄因子

應用基于強度的絕對定量方法(iBAQ)，對鑒定到的蛋白質進行定量，依照兩組間iBAQ 值之間的比值對蛋白及TF的表達量變化進行評定。肺癌組與癌旁組相比，表達上調的蛋白和TF(iBAQ 比值>3，同時鑒定到的肽段數>3個)分別有378種和有108(見表2)種，表達下調的蛋白和TF(iBAQ 比值小于0.33，同時鑒定到的肽段數>3個)分別有245種和50種(見表3)。

對于這些差異表達的TF，通過查閱文獻發(fā)現，有許多已經被報道與肺癌或者與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關。如UHRF1在多種癌癥中過表達，以其在維持DNMT1介導的DNA甲基化中的積極作用而聞名，并通過促進細胞增殖及在癌細胞的轉移過程中發(fā)揮重要作用[18]。有研究[19]指出FOXA1通過轉錄調控網絡來調節(jié)上皮-間質轉化(EMT)，在肺癌轉移的早期是一種重要的負性調節(jié)劑。NFATc1是一種調節(jié)破骨細胞生成、T細胞發(fā)育和巨噬細胞功能的轉錄因子。通過以獨立于TGF-β信號傳導的方式上調轉錄抑制因子Snail和Zeb1來抑制E-鈣粘蛋白表達，促進腫瘤細胞的侵襲轉移[20]。這些差異表達的TF可能就是潛在的生物標志物或可作為治療的靶點，也為接下來的大樣本和深入研究指明了一些方向。

三、差異表達蛋白及轉錄因子的信號通路分析

為了對肺癌組織及癌旁組織的分子特征得到更進一步的認識，我們對組織中差異表達蛋白及TF調節(jié)的信號通路進行了KEGG信號通路分析，結果顯示，這些差異的表達蛋白及TF，除了在細胞質DNA感應途徑(Cytosolic DNA-sensing pathway)、Notch信號傳導途徑(Notch signaling pathway)、核苷酸切除修復(Nucleotide excision repair)、錯配修復(Mismatch repair)、基底轉錄因子(Basal transcription factors)、剪切體(Spliceosome)明顯的富集現象之外，在VEGF信號通路(VEGF signaling pathway)、細胞周期(Cell cycle)、癌癥轉錄失調(Transcriptional misregulation in cancer)等也有明顯的富集現象。對于上述信號通路，有些與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關，有些被運用到抗腫瘤的策略中。如研究已證實VEGF信號通路參與腫瘤周圍新生內皮細胞的遷移、增殖，在腫瘤周圍血管新生的過程中具有重要的作用。VEGF受體信號轉導途徑可作為抗腫瘤治療方案的理想靶點[21]。又如Notch信號通路是一條決定細胞命運、保守而重要的信號轉導通路，影響發(fā)育過程中多種細胞的分化、增殖和凋亡，研究發(fā)現其與肺癌的發(fā)生、發(fā)展相關[22]。TF在大多數人類癌細胞中過分活躍，這讓他們成為抗癌藥物的開發(fā)的目標。研究差異表達蛋白及TF的信號通路，說明它們的確起著關鍵的作用，為未來深入的研究提供了一些重要的依據。

表2 上調TF

表3 下調TF

討 論

近年來隨著對肺癌研究的不斷深入，對其病因、發(fā)生發(fā)展、治療及預后知識不斷更新。除了形態(tài)學特征之外，近年來越來越多的研究致力于尋找能評估和預警肺癌術后轉移和復發(fā)的分子標記物、篩選可以為肺癌個體化治療提供依據的靶點，與肺癌相關的分子生物學研究成為肺癌研究的熱點。

低豐度的TF中蘊含著豐富的與疾病相關的病理信息，通過確保特定基因的正確表達，轉錄調控系統(tǒng)在控制許多生物過程中起著核心作用，但在樣品的處理過程中，由于與容器表面發(fā)生非特異性結合及其他溶劑的稀釋，低豐度的蛋白在分離和檢測前就已經丟失，如何將其從高豐度的蛋白中分離出來并進行鑒定一直是困擾著我們的一個問題。經過不斷的嘗試與努力，我們研發(fā)的catTFRE技術，極大的提高了TF的富集效率及鑒定效率。本研究證實了在組織水平上catTFRE技術同樣可以高效富集和鑒定TF，為接下來大樣本、高數量鑒定肺癌組織的TF提供了技術支持。本研究還對差異表達的TF及蛋白做了KEGG通路分析，發(fā)現一些通路的確與一些腫瘤相關，而這些TF及相關通路可能就是我們未來研究的方向，或許我們可以從中找到肺癌發(fā)生發(fā)展甚至新的治療策略的突破口。

綜上所述，本研究提供的一種高效富集肺癌及癌旁組織轉錄因子的方法-catTFRE技術，并根據富集到的TF及蛋白復合物，對肺癌與癌旁組織差異表達TF和蛋白的分析，我們發(fā)現一些TF在肺癌的發(fā)生、發(fā)展的過程中起到調控作用，TF的表達變化，可能使一些與細胞生長、分裂和增殖有關的蛋白異常表達而導致增殖失控、凋亡受阻以及侵襲與轉移等，使細胞在整個調控網絡上表現出與正常細胞的許多區(qū)別，最終引起肺癌的發(fā)生。通過對肺癌組織及癌旁組織TF的鑒定及分析研究，有助于解釋TF與肺癌發(fā)生之間的關系，為未來對大規(guī)模肺癌的深入研究提供一些重要的依據和基礎。