基于Cu2+修飾Fe3O4磁性微球對尿液中左氧氟沙星吸附性能研究及應用

張博，賀茂芳，胡婭琪，韓祿，唐一梅，張育珍

(1.西安醫學院 藥物研究所，陜西 西安 710021；2.西安醫學院 藥學院，陜西 西安 710021)

左氧氟沙星(Levofloxacin，LEV)是通過抑制細菌DNA旋轉酶的活性，阻止細菌DNA的合成和復制而導致細菌死亡，在臨床治療、農牧養殖中被廣泛使用[1-3]。目前，可用于檢測左氧氟沙星的方法較多[4-8]，如紫外-可見分光光度法、熒光猝滅法、高效液相色譜法、液相色譜-質譜法等，然而這些方法樣品前處理繁瑣、對目標分子選擇性差、液-質聯用實驗成本高。為克服以上問題，本文制備Fe3O4@SiO2/IDA-Cu功能化磁性微球，并建立一種磁固相萃取-高效液相色譜法可對復雜生物樣品尿樣中左氧氟沙星特異性吸附富集，檢測專屬性強、便捷、可有效地降低樣品基質的干擾。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

左氧氟沙星(純度為99%)、肉桂酸(CIN，純度為99%)、布洛芬(IBU，純度為98%)均由武漢那拉白醫藥化工有限公司提供；乙腈、甲酸均為色譜純；甲醇、無水乙醇、乙二醇、正硅酸乙酯(TEOS)、甲苯、3-(2，3-環氧丙基)丙基三甲基硅烷(KH-560)、亞氨基二乙酸(IDA)、無水三氯化鐵、檸檬酸三鈉、鹽酸、氨水均為分析純；空白尿液由健康受試者提供；實驗用水為超純水。

DIONEX P680A型高效液相色譜儀；PB-10型酸度計；CPA225D型電子分析天平；SQP QUINTIX24-1CN型精密分析天平；JTF-100PPL型水熱合成反應釜；TS-211B型氣浴搖床；SB-5200DTD型超聲波清洗器；DZF-6020型真空干燥箱；T09-1S型恒溫磁力攪拌器。

1.2 實驗方法

1.2.1 功能化磁性微球的制備 查閱相關文獻[9-12]，優化部分實驗條件，采用溶劑熱法合成Fe3O4磁性粒子。稱取適量上述磁性粒子，超聲分散于20%檸檬酸三鈉溶液中并靜置2 h，磁性分離，轉移至三頸瓶，加入水和無水乙醇，攪拌并超聲分散45 min，再加入適量濃氨水，超聲分散15 min，逐滴加入正硅酸乙酯(TEOS)，攪拌反應12 h，磁性分離，依次用水、無水乙醇交替清洗粒子3次，50 ℃減壓干燥，即得到棕褐色Fe3O4@SiO2磁性微球。

取0.5 mL的KH-560，加入到10 mL無水甲苯中即為溶液Ⅰ。稱取適量Fe3O4@SiO2磁性微球于三頸瓶中，加無水甲苯50 mL，超聲分散10 min后110 ℃回流，緩慢滴加溶液Ⅰ，攪拌反應12 h后，磁性分離。依次用甲苯、無水乙醇清洗粒子3次，即得到Fe3O4@SiO2@環氧基磁性微球。

在100 mL三頸瓶中，分別加入上述微球和純化水適量并超聲分散，再加入IDA溶液(無水碳酸鈉溶液溶解)調pH值為8.5，在80 ℃下油浴反應12 h，磁性分離后置于50 mL離心管中，加入5 mmol/L的CuSO4溶液，在25 ℃下孵育3 h，反應結束后用蒸餾水清洗磁性微球2次，50 ℃減壓干燥，即得Fe3O4@SiO2/IDA-Cu磁性復合材料。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：Agilent HC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫25 ℃，流動相：乙腈∶0.1%甲酸水溶液=15∶85，流速1.0 mL/min，檢測波長264 nm，進樣體積20 μL。

1.2.3 對照品儲備液配制 精密稱取50.29 mg左氧氟沙星，置于100 mL容量瓶內，加入純化水稀釋至刻度，搖勻，即得0.497 9 mg/mL左氧氟沙星對照品儲備液。

精密稱取10.64 mg布洛芬，置于100 mL容量瓶內，加入純化水稀釋至刻度，搖勻，即得0.104 3 mg/mL 布洛芬對照品儲備液。

精密稱取40.17 mg肉桂酸，置于100 mL容量瓶內，加入純化水稀釋至刻度，搖勻，即得0.397 7 mg/mL 肉桂酸對照品儲備液。

1.2.4 供試品溶液配制 精密吸取1.2.3節左氧氟沙星儲備液1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加純化水稀釋至刻度，即得濃度為49.79 μg/mL的左氧氟沙星對照品溶液。

精密吸取尿液2.0 mL，轉移至50 mL具塞塑料離心管中，加入上述左氧氟沙星對照品溶液0.5 mL，加純化水稀釋至50 mL，再稱取1.2.1節Fe3O4@SiO2/IDA-Cu磁性微球約30 mg，加至離心管中，氣浴搖床25 ℃吸附30 min，磁性分離，5%氨水-甲醇溶液0.4 mL振蕩洗滌2次，合并2次洗脫液，并定容至1.0 mL，用0.45 μm微孔濾膜過濾，HPLC分析。

1.2.5 陰性對照溶液配制 參照1.2.4節實驗步驟，不加左氧氟沙星對照品溶液，制成陰性對照溶液。

2 結果與討論

2.1 吸附-解吸附性能考察

2.1.1 磁性微球用量對吸附容量的影響 精密吸取尿液5份各2.0 mL，分別置于5支50 mL離心管中，加入1.2.4節左氧氟沙星對照品溶液各 0.5 mL，再依次加入20，25，30，35，40 mg的磁性微球。按照1.2.4節步驟進行吸附實驗，按照1.2.2節色譜條件分析，以峰面積判斷吸附容量與磁性微球用量之間的關系，結果見圖1。

圖1 洗脫液色譜峰面積與磁性微球用量的關系Fig.1 Relationship between peak area of elution chromatography and magnetic beads dosage

由圖1可知，磁性微球用量20～30 mg時，左氧氟沙星測定的峰面積快速變大，而用量超過30 mg時，峰面積變化趨于穩定，顯示不能進一步提高吸附容量，因此后續實驗磁性微球用量定為30 mg。

2.1.2 吸附時間對吸附容量的影響 精密吸取尿液2.0 mL 5份，每份加入30 mg的磁性微球，按照1.2.4節步驟操作，分別吸附10，20，30，40，50 min，以峰面積判斷吸附容量與吸附時間之間的關系，結果見圖2。

圖2 洗脫液色譜峰面積與吸附時間的關系Fig.2 Relationship between peak area of elution chromatography and adsorption time

由圖2可知，當吸附30 min時，吸附容量達到最大值。

2.1.3 洗脫溶劑的組成對解吸附的影響 按照1.2.4節步驟操作，分別加入0，2%，5%，10%，20%氨水-甲醇溶液洗脫，對比5種不同洗脫結果的色譜峰面積，結果見圖3。

圖3 洗脫液色譜峰面積與洗脫溶劑的關系Fig.3 Relationship between peak area of elution chromatography and eluting solvent

由圖3可知，濃度在5%以上氨水-甲醇溶液并不能快速顯著的提高洗脫效率，可能是因為左氧氟沙星、氨水和Cu2+競爭性吸附趨于平衡，所以確定5%氨水-甲醇溶液洗脫效果最佳。

2.1.4 洗脫時間對解吸附的影響 稱取30 mg磁性粒子4份，按照1.2.4節步驟操作，第1次洗脫10，20，30，45 min，結果顯示30 min洗脫效果最佳，繼續對該份樣品進行第2次洗脫，分別洗脫10，15，30 min，結果顯示15 min基本洗脫完全。最終確定為2次洗脫，第1次30 min，第2次15 min，結果見圖4。

圖4 洗脫液色譜峰面積與洗脫時間、洗脫次數的關系Fig.4 Relationship between peak area of elution chromatography and elution time，elution times

2.2 方法學考察

2.2.1 作用機制與專屬性考察 左氧氟沙星藥物分子結構中3，4位分別為羧基和酮羰基，易與金屬離子形成配位化合物，而肉桂酸、布洛芬等其它藥物分子結構中沒有此結構，因此這些物質不能與Cu2+發生該配位反應。所以可以推斷，制備的Fe3O4@SiO2/IDA-Cu可以特異性的吸附左氧氟沙星。

精密吸取空白尿液2.0 mL，加入1.2.3節左氧氟沙星、肉桂酸與布洛芬對照品溶液各0.2 mL，按照1.2.4節操作制備供試品溶液，另取1.2.5節陰性對照溶液，并按照1.2.2節色譜條件，結合梯度洗脫分析，0～5 min乙腈∶0.1%甲酸水溶液=15∶85，5～30 min乙腈∶0.1%甲酸水溶液=50∶50，30～50 min乙腈∶0.1%甲酸水溶液=50∶50，色譜分析結果見圖5。

圖5 專屬性考察色譜圖Fig.5 Chromatogram of specific investigation test

a.混合液中左氧氟沙星、肉桂酸與布洛芬色譜圖；b.洗脫液中左氧氟沙星色譜圖；c.陰性對照色譜圖

結果表明，本文中制備的磁性微球，在復雜樣本體系中可選擇性的吸附左氧氟沙星而布洛芬與肉桂酸無干擾，專屬性良好。

2.2.2 線性關系考察及檢出限、定量限 將左氧氟沙星對照品儲備液稀釋成濃度為0.50，1.99，4.98，19.92，49.79，99.58 μg/mL的系列標準溶液，并按照1.2.2節色譜條件，進樣分析，以標準溶液濃度(mg/mL)為橫坐標，峰面積為縱坐標，求得回歸方程及相關系數為y=0.794 2x-0.296 1，r=0.999 8，表明線性關系良好，線性范圍0.5～99.58 μg/mL，分別以3倍、10倍信噪比(S/N)計算得出檢出限(LOD)為0.2 μg/mL和定量限(LOQ)0.5 μg/mL。再以19.92 μg/mL的標準溶液為分析對象，按照1.2.4節分析，計算得精密度RSD為1.93%。

2.2.3 加標回收率 精密吸取6份尿液各2.0 mL，按照1.2.4節方法制備供試品溶液，再分別加入低、中、高三個不同濃度的左氧氟沙星溶液，按照1.2.2節色譜條件分析，結果見表1。

表1 加標回收率實驗結果Table 1 Experimental results of spiked recoveries

由表1可知，平均回收率為95.85%，RSD為1.97%，表明該方法的回收率良好。

2.3 樣品測定

精密吸取空白尿液5份，各2.0 mL，分別轉移至5個50 mL離心管中，按照1.2.4節步驟制備供試品溶液，同時按照1.2.2節色譜條件進樣分析，分別記錄峰面積，并計算回收率，結果見表2。

表2 尿液樣本含量測定結果Table 2 Test results of five human serum samples

3 結論

本文制備了一種新型功能化Fe3O4@SiO2/IDA-Cu磁性微球材料，通過大量的吸附-解吸附性能考察實驗，對影響吸附-解吸附性能的主要因素進行了研究，進而優化實驗條件，并對尿樣中左氧氟沙星進行萃取、富集和檢測，獲得滿意的結果。

(1)在樣品前處理過程中，分別對不同樣品進行了萃取、富集，研究了經Cu2+修飾的磁性微球對左氧氟沙星的選擇性吸附機理。

(2)將Cu2+鍵合在Fe3O4磁性微球表面，使其表面金屬親和活性增加，選擇性吸附性能增強，聯合高效液相色譜儀建立MSPE-HPLC法，可有效降低尿液中基質的干擾，富集微量乃至痕量的左氧氟沙星，為復雜生物樣本檢測提供了方便、快捷、低成本的檢測新方法。