用蛋白組學技術鑒定肝細胞損傷大鼠血清中的差異蛋白

苗玉發,康慧君,王曉姝,李路路,曲 哲,楊艷偉,張河戰,李 波

(中國食品藥品檢定研究院,北京 100176)

酮康唑(ketoconazole,KTZ)化學名稱為1-乙?；?4{4-[2-(2,4-二氯苯基)-2(1H-咪唑-1-甲基)-1,3-二氧戊環-4-甲氧基]苯基}-哌嗪,是一種合成的咪唑類抗真菌劑,對皮膚真菌、酵母菌、雙相真菌和真菌綱具有抑菌和殺菌活性。 作用機制為抑制真菌細胞膜麥角甾醇的生物合成并改變細胞膜脂類化合物的組成,影響細胞膜的通透性,抑制其生長[1]。 KTZ 在胃內溶解后易被吸收,其吸收后在體內可廣泛分布到關節液、唾液、膽汁、尿液、乳汁、皮膚軟組織和糞便中等。

2011 年8 月31 日,在第40 期《藥品不良反應信息通報》中,200 mg KTZ 口服片劑被提示有嚴重肝毒性,因為臨床上KTZ 已經引起患者嚴重的肝損傷。

四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4)是一種無色的液體,在動物體內能夠引起肝細胞變性壞死,可以模擬人肝病變模式,而且個體差異較小,所以在研究中常用作肝細胞損傷模型的造模劑[2]。

目前,臨床上預測肝損傷的常用指標是谷丙轉氨酶(alanine transaminase, ALT),雖然其具有一定的特異性,但靈敏度存在不足,尋找靈敏度和特異性都較好的生物標志物一直是肝毒性研究的方向。本研究使用KTZ 和CCl4在Wistar 雄性大鼠中構建肝細胞損傷模型,以肝病理改變和ALT 升高兩者都具備作為判斷建模成功的標準。 對于建模成功的動物,制備外周血清,采用雙向電泳技術篩選血清差異蛋白,再采用質譜技術鑒定蛋白質類型,尋找潛在的肝細胞損傷生物標志物。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

7 周齡Wistar 雄性大鼠96 只,SPF 級,160 ～200 g,從北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京) 2016-0006]購買。 在中檢院安全評價研究所SPF 級屏障系統[SYXK(京) 2016-0045] 中飼養,每籠3 只。 實驗動物使用與管理委員會(IACUC)批準號：IACUC2014026。 實驗者在研究過程中遵循"3R"原則,并給予實驗動物應有的福利和關懷。

1.2 主要試劑與儀器

200 mg KTZ 片劑(西安楊森制藥公司);泡漲液(Bio-Rad 公司);蛋白質Marker(中科院上海生物化學研究所);血清蛋白提取試劑盒(美國Epigentek公司);CCl4(北京化工廠);ALT 檢測試劑盒(日本和光株式會社);蘇木素-伊紅染色液(北京世濟合力生物科技有限公司)。 5810R 型離心機(Eppendorf 公司);7180 型全自動生化分析儀(日本日立公司);Tissue-Tek VIP6 日本櫻花全封閉組織脫水機(日本櫻花精機株式會社);分析天平(島津公司);等電聚焦電泳儀(Amersham 公司);SDSPAGE 電泳儀(Amersham 公司);凝膠掃描儀(GE healthcare 公司);分光光度計(島津公司);質譜儀(Bruker 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 藥物配制、給藥劑量、分組及解剖

將KTZ 片劑溶于水混勻配制成40 mg/mL 的混懸溶液,冷藏備用;CCl4用精制花生油配制成30%的溶液,使用當天配制。 KTZ 給藥劑量為225 mg/kg,CCl4(V/V：30%)給藥體積為10 mL/kg。 實驗設置KTZ 組、CCl4組和對照組。 給藥方式為灌胃給藥。 KTZ 組每天給藥1 次,共給藥2 次。 第2 次給藥結束后4、24、48 和72 h 分別解剖8 只動物,制備血清,肝做病理切片。 CCl4組給藥1 次后4、24、48和72 h 分別解剖8 只動物,制備血清,肝做病理切片。 對照組給予等量生理鹽水1 次后4、24、48 和72 h 分別解剖8 只動物,制備血清,肝做病理切片。動物解剖前16 ～18 h 開始禁食,正常飲水。

1.3.2 外周血清和病理切片制作

動物麻醉后,從腹腔大靜脈取2 ～3 mL 全血,靜置約40 min 后,3000 r/min 條件下離心制備血清。 肝取材后放入10%甲醛固定液中固定24 h,置換新鮮固定液繼續固定24 h。 然后將肝組織修塊切成1 cm×1 cm×0.2 cm 大小的組織塊,裝入包埋盒中,經過脫水,透明后包埋成蠟塊,并制作切片,進行蘇木素-伊紅(HE)染色,鏡下觀察肝組織病理改變[3-4]。

1.3.3 血清蛋白提取

收集對照組血清,以及KTZ 組和CCl4組給藥后ALT 顯著升高且肝發生病理變化的24 h 時間點的血清,每組動物的血清按組別分別進行混合后,按照試劑盒說明書進行蛋白質提取。

1.3.4 雙向凝膠電泳

將KTZ 組、對照組和CCl4組各1.0 mg 蛋白質加入重泡漲液中,使總體積為450 μL,每組設3 個重復樣。 用等電聚焦儀進行第一向固相pH 梯度等電聚焦電泳：12 h 重泡漲;250 V,0.5 h;1000 V,0.5 h ;8000 V,9 h。 結束后,膠片經平衡后進行第二向垂直平板SDS-PAGE 電泳[5-7]。

1.3.5 圖像分析

將膠塊在考馬斯亮藍中染色,然后脫色至背景清晰。 拍攝后用ImageMaster 7.0 軟件進行分析,與對照組相比,KTZ 組和CCl4組同時具備大于1.5 倍的差異點作為目的蛋白。

1.3.6 酶解及質譜分析

將目的蛋白質點放入試管中,37℃超純水中浸泡30 min,在脫色液中震蕩脫色30 min,反復2 ～3遍,直至膠塊和脫色液變無色;在100% ACN 中浸泡15 min,真空條件下離心干燥5 min;加入15 μL Trypsin 酶液,冷藏45 min,10 h 空氣浴,然后將反應液收集試管中;加入50 μL 33% ACN 和0.1% TFA(三氟乙酸),萃取30 min,離心后吸取上清放置試管中。 用含66% ACN 和0.1% TFA,和含100%ACN 和0.1% TFA 的萃取液再萃取一次。 將反應液和3 次萃取液混合,凍干至5 ～6 μL,冷藏備用。 質譜分析時取樣品0.5 μL 點靶,烤干,重復2 次,點基質0.3 μL,干燥后在質譜儀上分析[8]。

1.3.7 數據庫檢索

在NCBInr 數據庫中檢索蛋白質,參數設置：種類為Mus musculus;酶為胰蛋白酶,允許1 個漏切位點;肽質量容忍差異為0.2;MS/MS 容忍差異為0.3。使用UniProt 提供的數據庫查詢蛋白質功能。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 ALT 檢測結果

KTZ 給藥2 次后,給藥結束后24 h,與對照組相比,ALT 值升高,差異具有統計學意義(P＜0.05)。給藥結束后4 h,48 h 和72 h,與對照組相比,ALT 的差異不具有統計學意義。 CCl4給藥后4 h,與對照組相比,ALT 值升高,差異具有統計學意義(P ＜0.05),24 h 時達到峰值,且差異具有統計學意義(P＜0.01)。 48 h 開始下降,72 h 顯著下降,但仍高于對照組水平,差異具有統計學意義(P＜0.01),結果見表1。

2.2 病理檢查結果

KTZ 給藥結束后24 h,病理結果顯示肝輕度肝細胞泡沫樣變性,見圖1A,箭頭所指為泡沫樣變性。CCl4給藥結束后24 h,肝中央靜脈周圍中度肝細胞氣球樣變和肝細胞壞死,見圖1C,細箭頭所指為氣球樣變,粗箭頭所指為肝細胞壞死。 圖1B 顯示的對照組動物肝病理圖片。

2.3 雙向凝膠電泳結果

選取KTZ 組和CCl4組給藥結束后24 h 制備的血清,進行雙向蛋白電泳。 與對照組相比,KTZ 組和CCl4組共獲得4 個相同的蛋白差異點。 含量增加的有點37,見圖2;含量減少的有點27、93 和195,見圖3(以點195 為代表)。

2.4 質譜鑒定結果

通過查詢UniProt 數據庫,發現與肝細胞毒性相關的上調蛋白1 個,下調蛋白3 個,結果見表2。

表1 各組ALT 檢測結果(±s,n=8,IU/L)Table 1 Results of ALT analysis

表1 各組ALT 檢測結果(±s,n=8,IU/L)Table 1 Results of ALT analysis

注：與對照組比較,?P＜0.05,??P＜0.01。Note. Compared with the control group,?P＜0.05,??P＜0.01.

分組Groups對照組Control group KTZ 組KTZ group CCl4 組CCl4 group 4 h 33±7 42±13 80±24?24 h 32±8 140±106? 4170±1933??48 h 32±4 56±35 2994±843??72 h 34±6 46±18 728±315??

圖1 肝組織病理改變的HE 染色圖Figure 1 Pathological changes of the rat liver tissues(HE staining)

3 討論

本研究中采用肝病理改變合并ALT 升高作為判斷肝細胞損傷的標準,確保采集到的血清是肝細胞損傷發生時的血清,確保鑒定出的差異蛋白是肝細胞損傷發生時的差異蛋白。 KTZ 導致的肝細胞損傷,在臨床中具有非常明顯的個體差異,在動物體內也不例外。 前期探索研究中,發現雄性大鼠比雌性大鼠更容易誘導肝損傷模型,因此,本研究中只采用雄性大鼠進行研究,雌性大鼠肝細胞損傷后的差異蛋白可以在以后實驗中繼續探索研究。 探索實驗還發現,225 mg/kg KTZ 給藥1 次后,在2 h、4 h、6 h、8 h、24 h、48 h 和72 h 時,ALT 都沒有出現升高。 連續給藥2 次后4 h,仍只有少數動物的ALT升高,且無統計學意義。 在24 h 時,才出現有統計學意義的顯著性升高,這說明此劑量水平的KTZ 對大鼠肝細胞損傷的個體差異較大。 更高劑量的KTZ并沒有產生明顯的毒性劑量效應,所以本實驗中未進行更高劑量的肝毒性研究。 實驗中CCl4給藥一次后2 h,ALT 未出現統計學意義的顯著性升高。 4 h 起,所有時間點ALT 都出現統計學意義的顯著性升高,48 h 達到峰值,72 h 開始下降,但仍顯著性高于對照組。 說明此劑量CCl4的肝細胞毒性遠遠大于225 mg/kg 劑量的KTZ,且個體差異較小,是急性肝細胞損傷理想的誘導劑。 本研究中CCl4的劑量約為3 mL/kg,目的是通過高劑量造成肝細胞的急性變性壞死,然后研究肝損傷發生時外周血中的差異蛋白。 高劑量的CCl4還可以避免因動物個體差異導致的造模失敗。 KTZ 組和CCl4組24 h 點采集到的發生明顯肝損傷時的外周血清分別用于雙向電泳,并與對照組血清比較,篩選出共同的差異性蛋白用于質譜鑒定。

圖2 點37 的雙向凝膠電泳圖Figure 2 Two dimensional gel electrophoresis images of Match ID 37

表2 質譜鑒定的差異蛋白質Table 2 Differential proteins identified by LC MS/MS analysis

圖3 點195 的雙向凝膠電泳圖Figure 3 Two dimensional gel electrophoresis images of Match ID 195

雙向凝膠電泳是一種應用了20 余年的成熟技術,對蛋白質組的分辨率最高、重復性最好。 根據蛋白質的等電點和分子量不同,進行兩次電泳將蛋白質分離,一般能分辨到1000 ～3000 個蛋白質點。蛋白分離后需經染色將蛋白顯示出來,常用的染色方法有考馬斯亮藍染色和銀染。 熒光染色和同位素標記也時常應用。 銀染可檢測到2～5 ng 的蛋白,考馬斯亮藍染色可檢測到8～50 ng 的蛋白,因此,銀染較考馬斯亮藍染色敏感。 銀染雖然靈敏度高,但之后的質譜鑒定兼容性欠佳。 考馬斯亮藍雖然靈敏度低,但其操作簡單且與質譜匹配度好,因而一直被廣泛應用[9]。 本研究考慮到凝膠染色的靈敏度和質譜兼容性問題,選擇了考馬斯亮藍染色。 這種染色方法的相對低靈敏度會導致一些低含量蛋白漏染,此外,多數糖蛋白不能被考馬斯亮藍染色,因此,大多數差異性的糖蛋白也不能夠被識別出來。

ApoAI 是高密度脂蛋白( high - density lipoprotein,HDL)中的主要蛋白質,具有促進膽固醇的代謝以及調節HDL 的代謝作用,臨床上HDL 水平的升高有助于推遲或阻止動脈粥樣硬化的發生。有研究表明冠心病患者血清中Apo AI 的水平較低,肝硬化患者血清中ApoAI 水平非常顯著性降低,肝硬化合并肝性腦病的患者血清中載脂蛋白AI、B 水平以及白蛋白水平也明顯降低[10-11]。 Lee 等[12]采用雙向電泳技術和質譜技術對羊子宮腔液的蛋白質進行研究,結果顯示羊在妊娠時ApoAI 增加明顯。

肝細胞急性損傷時肝細胞膜被破壞,細胞內物質被釋放入血,包括大量血紅蛋白。 游離的血紅蛋白具有氧化還原活性,能破壞氧化還原微環境,導致細胞組織毒性。 血紅蛋白結合蛋白和結合珠蛋白可以與血紅蛋白結合從而起到抗氧化作用。 此外,當血紅蛋白結合蛋白和結合珠蛋白耗盡時,游離的ApoAI 也可以作為抗氧化劑與血紅蛋白結合,是消除血紅蛋白氧化還原活性的又一有效途徑[13]。本研究中KTZ 和CCl4能導致大鼠肝細胞急性損傷,血紅蛋白釋放入血,為清除血紅蛋白的氧化還原活性,ApoAI 代償性增加,這可能是導致24 h 點血清中ApoAI 含量上調的原因,但具體的機制仍不清楚,仍需要進一步研究各個時間點ApoAI 的變化情況。

GSH-Px 是一種重要的過氧化物分解酶,可以保護細胞膜的結構及功能不受干擾和損害[14]。 血漿GSH-Px 構成與胞漿GSH-Px 相同,由4 個相同的22×103 的亞基構成的四聚體,廣泛存在于各個組織中。 GSH-Px 活性在妊娠期糖尿病孕婦血清中顯著降低,可作為妊娠期糖尿病預測診斷指標之一[15]。有研究顯示低水平的硒和GSH-Px 可作為輔助診斷晚發型重度子癇前期的有效生物學指標[16]。 此外,中藥肝毒性研究結果表明GSH-Px 含量降低與肝毒性發生相關性比較大,而且指標靈敏性較強[17]。 本研究中肝損傷發生時,血中的GSH-Px 催化血中的過氧化物轉化,消耗增加導致含量下調,與臨床上肝毒性研究結果也相吻合。

Shore 于1973 年首先發現ApoE,Rall 等于1982年測出ApoE 的蛋白質一級結構。 人ApoE 是由299個氨基酸殘基組成,富含精氨酸,主要由肝合成。ApoE 存在于血漿乳糜微粒(chylomicron, CM)、極低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein, VLDL)及其殘粒中[18]。 ApoE 是低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL)受體和CM 殘粒受體的配體,它不僅參與脂蛋白代謝,還參與免疫調節和神經組織再生。 有研究表明早期帕金森病患者和晚期帕金森病患者血漿中ApoE 蛋白水平均顯著低于對照組[19]。 本研究中ApoE 表達下調,可能與大鼠肝細胞損傷后ApoE 合成減少,以及消耗增加相關。

大鼠VDBP 是主要由肝合成和分泌的單體酸性糖蛋白,分子量大約52×103～54×103,其mRNA 總長為1700 個堿基。 VDBP 能與血液中維生素D 及其代謝產物25(OH)D 特異性結合,對甾醇類物質轉運有重要作用。 有研究表明,VDBP 還能與肌動蛋白結合,阻止肌動蛋白的聚合。 此外,還發現VDBP 還能與B 淋巴細胞和T 淋巴細胞表面的某種膜蛋白結合,在免疫反應中發揮作用[20]。 有研究顯示,肝纖維化患者和肝癌患者的外周血中VDBP 含量降低,而且疾病越嚴重,VDBP 降低幅度就越大[21]。 本研究中大鼠血清VDBP 含量在肝細胞損傷發生后減少,可能與肝細胞合成VDBP 減少,維生素D 甾醇類物質轉運消耗增加有關。 肝損傷發生后,機體內免疫反應也會發生復雜變化,VDBP 也可能會參與免疫反應,多種累加效應導致檢測時間點血中VDBP 減少,但具體機制仍需繼續探索。

本研究鑒定出的4 種差異蛋白,可以作為肝細胞損傷的潛在生物標志物,在不同的動物肝細胞損傷模型中進一步進行靈敏度和特異性驗證研究。