河南產貓爪草的質量分析研究

梁利香，周斌，喬新榮

(信陽農林學院，信陽市中藥資源開發工程技術研究中心，信陽市中藥質量分析檢測重點實驗室 ，河南 信陽 464000)

貓爪草為毛茛科植物小毛茛(RadixRanunculiTernati.)的干燥塊根，性溫，味甘、辛，歸肝、肺經，功能化痰散結、解毒消腫，用于治療瘰疬痰核、疔瘡腫毒、蛇蟲咬傷[1]。貓爪草含有多種成分，如糖類、黃酮類與苷類、氨基酸、生物堿苷類、有機酸、甾醇及酯、揮發油和微量元素等，具有抗結核、抗菌、抗癌、免疫調節作用、保護性抑制作用、抗氧化作用等多種藥理活性[2]。貓爪草近年來由于其抗腫瘤活性備受人們的關注，諸多實驗研究表明貓爪草多糖(PRT)是其抗腫瘤、抗氧化、保肝、調節免疫的活性成分[3-8]。河南貓爪草種植和產量在全國占有重要地位，尤其信陽地區既是貓爪草的發現地和野生分布區，又是目前國內貓爪草的主要栽培區。為了更好控制河南貓爪草質量，本文按照《中國藥典》(2015年版)對河南產貓爪草從性狀鑒別、橫切面顯微鑒別、薄層色譜鑒別、水分、總灰分、酸不溶性灰分檢查和稀乙醇浸出物測定等方面進行了研究，并增加粉末顯微鑒別、粗多糖和多糖含量測定項目。以期為河南產貓爪草的質量控制、河南產貓爪草的道地性、原產地標記的認定、資源開發和質量控制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料 貓爪草藥材從不同產地收集，由信陽農林學院、信陽市中藥質量分析檢測重點實驗室鑒定為毛茛科植物小毛茛(RanunculusternatusThunb.)的干燥塊根。樣品信息見表1。

1.1.2 試劑 無水葡萄糖標準品(中國計量科學研究院，批號為GBW1006213001,含量為99%)；酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸、苯酚、無水硫酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、乙醇、正丁醇、無水乙醇、冰醋酸等均為分析純，純化水自制。

1.1.3 儀器 TU-1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；AB-135-S型電子天平(梅特勒-托利多儀器制造有限公司)；SCQ -8201E 超聲清洗儀(上海聲彥超聲波儀器設備有限公司)；Carl Zeiss Primo Star可攝像生物顯微鏡(德國卡爾蔡司公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的制備

1.2.1.1 葡萄糖標準溶液的配制 將葡萄糖對照品干燥至恒重，精密稱定0.1042 g 于100 ml容量瓶中，加純化水充分溶解后，稀釋至刻度，搖勻，制得葡萄糖標準溶液。

表1 貓爪草樣品信息

1.2.1.2 標準曲線的制備 精密移取上述葡萄糖標準溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于6只100 mL容量瓶中，加純化水稀釋至刻度，搖勻后得葡萄糖對照品溶液。

精密稱取蒽酮0.1 g，加100 mL硫酸溶解，搖勻后即得硫酸蒽酮溶液。

分別精密移取各對照品溶液1.0 mL于10 mL具塞試管后，將試管置冰水浴中，迅速加入4.0 mL 硫酸蒽酮溶液。再將試管置沸水浴中顯色10 min后，取出置冰水浴中冷卻10 min，然后將試管在室溫下放置 10 min。同時移取1.0 mL純化水，同法操作，作為空白溶液。按照紫外-可見分光光度法[9]，在625nm處測其吸光度。以濃度(C)為橫坐標、吸光度(A)為縱坐標，繪制成標準曲線，得回歸方程為A=0.01037C + 0.00907(r=0.9994)。結果表明：葡萄糖在10.42～62.52μg/mL范圍內線性關系良好。

1.2.2 貓爪草中多糖的含量測定

1.2.2.1 供試品溶液的制備 貓爪草藥材各樣品粉碎后，過60目篩網。取每種樣品粉末1.5g，各取3份。每份加約0.045g的α-淀粉酶和3倍量的純化水進行酶解。酶解溫度為 50℃，酶解溶液pH為6 ，酶解時間設為40min。酶解結束后，再加7倍量純化水超聲提取20 min，超聲功率為300 W。然后進行抽濾。濾渣再加純化水超聲提取2次，每次加水量為8倍量，每次提取時間為20 min，合并3次經酶解、協同超聲提取所得的提取液，將其濃縮至原體積的1/2 , 過濾，棄去前濾液10 mL，收集續濾液。精密移取續濾液1.0 mL于50 mL容量瓶中，加純化水至刻度，即得供試品溶液。

1.2.2.2 多糖溶液的制備 精密移取1.2.2.1項下貓爪草總糖續濾液10 mL于50 mL燒杯中，60℃條件下干燥。干燥后，加入1 mL純化水溶解，邊攪拌邊加入10 mL無水乙醇，靜置30min后，過濾，將沉淀全部轉移至濾紙上，用純化水-無水乙醇(1：10)的溶液洗滌沉淀3次。將帶濾紙的漏斗移至 25 mL的容量瓶上，多次用純化水沖洗將沉淀完全溶解加入容量瓶中，加純化水至刻度，即得多糖溶液。

1.2.2.3 多糖含量測定方法 精密移取各供試品溶液1.0 mL于10 mL具塞試管中，下起同標準曲線的制備項下“置冰水浴中”，測定其吸光度，并計算其含量。

1.2.3 薄層色譜實驗 分別吸取供試品溶液、對照藥材溶液各8μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-無水乙醇-冰醋酸-水(8：2：2：3)為展開劑展開后，取出晾干，再噴以茚三酮試液，熱風吹薄層板至斑點顯色清晰。

2 鑒別結果

2.1 來源鑒別

貓爪草為一年生草本，多生長在光照充足的路邊、山腳、田野、溪邊和濕潤的草地。粗短的根莖上著生簇狀的塊根。莖較柔軟纖弱，鋪散，高5～20 cm。基生葉叢生，葉柄長，葉片幼小時多單葉，近全緣，基部近心形。后逐漸至淺裂、3深裂或多次狹細分裂。莖生葉近無柄，且葉片多分裂成3～5狹長條狀裂片。莖多分枝，花單生莖頂端和分枝頂端，直徑1～1.8cm，萼片5～7枚，外表皮上著生稀疏的柔毛。花瓣5～8枚，多5枚，初開時亮黃色，逐漸變為白色。栽培大田中出現少數黃、白色塊夾雜的花朵情形。花托外表面無毛。聚合果近似球形，瘦果卵形。早春3月開花，果實5～6月成熟。果實成熟后地上部分逐漸枯萎。見圖1、圖2。

圖1貓爪草初開放的花 圖2少數貓爪草的花黃白色塊夾雜

2.2 性狀鑒別

貓爪草實際入藥部位由粗短的根莖及根莖上數個至數十個紡錘形簇生的塊根組成，形似貓爪，頂端有黃褐色殘存的莖或莖痕。表面黃褐色至灰黃色，略有縱皺紋，并有點狀須根痕或殘留須根。質堅實，斷面白色或黃白色，多實心，偶見有裂隙，粉性。氣微，味微甘。見圖3。

2.3 顯微鑒別

2.3.1 橫切面顯微鑒別 根莖皮層分布有數個須根維管束，木質部和韌皮部相間排列。塊根的表皮細胞切向延長，黃棕色，有的分化為表皮毛，微木化。皮層由20～30列細胞組成，壁稍厚，有紋孔，內皮層明顯。中柱小，木質部、韌皮部各2～3束，間隔排列。薄壁細胞充滿淀粉粒。結果見圖4、圖5。

圖3貓爪草藥材圖 圖4貓爪草須根維管束顯微圖 圖5貓爪草橫切面顯微圖

圖6貓爪草粉末顯微特征圖

2.3.2 粉末顯微鑒別 本品粉末淡棕色至黃棕色。導管多為具緣紋孔導管和螺紋導管，木質化。具緣紋孔導管紋孔較為密集，寬25～100μm，有的末端斜尖；螺紋導管寬為10～35μm。管胞木化，具緣紋孔密集，寬7～15μm，長120～350μm。表皮細胞狹長，橫切面觀，寬6～12μm，長85～178 μm，黃棕色，最外層表皮細胞多分化為基部寬，上部呈窄長的毛狀。表皮毛非木化，上部寬8～15 μm，有的有分支和多個橫隔，多斷裂。皮層細胞橫切面觀卵圓形、類三角形或圓形，直徑20～188 μm，縱切面觀圓柱形，長107～350 μm。壁較厚，上有稀疏排列的狹長單紋孔，上下橫壁上網狀紋孔密集。皮層細胞充滿淀粉粒。淀粉粒單粒呈球形、類球形或成多面錐體，直徑8～25μm，臍點點狀。淀粉粒多為多面錐體，低倍鏡下觀察，臍點如十字形、人字形或星芒狀。塊根根尖組織細胞類長方形、類方形或卵圓形，直徑70～100 μm，棕色或無色，有的可見稀疏的細小點狀紋孔，內含深棕色核狀物(見圖6)。

偶爾可以看見莖葉等地上部分混淆進去的粉末特征。如氣孔，多為不定式或環式；非腺毛，有分枝；或分泌組織。見圖7。

2.4 薄層色譜鑒別

色譜實驗結果見圖8。1～4樣品供試品色譜中，在與對照藥材相應的位置上，顯相同顏色的斑點。

2.5 多糖含量測定結果

貓爪草中多糖含量的測定結果見表2。

表2 貓爪草中多糖含量(n=3)

表2(續)

由表2可知，河南信陽地區貓爪草的多糖含量為30.78%(n=6，RSD=4.27%)。用單因素方差分析得其與商丘(樣14)、周口(樣15)、平頂山(樣16)和開封(樣17)不具有顯著性差異(p>0.05)，但其分布量較大，且與其余7個采樣點(7-13)差異顯著(p<0.01)。

3 結論與討論

試驗結果表明：河南不同產地貓爪草的性狀、塊根的橫切面顯微特征、TLC鑒別基本一致，無顯著差異；河南不同產地貓爪草多糖的含量差異明顯，以河南信陽淮濱產貓爪草多糖的含量最高，河南信陽淮濱和息縣產貓爪草中多糖的含量無明顯差異，但均高于其它地區。為信陽是優質高效的貓爪草道地藥材產區提供了一定的判斷依據。

貓爪草根頂端應為粗短的根莖，但因須根較多，簇生的塊根也較多，本研究所做橫切片還不十分滿意，需要進一步觀察研究。貓爪草入藥時常含有少量非入藥部位，觀察粉末顯微特征時要注意區分。大田栽培的貓爪草的花出現黃白夾雜色塊的原因需要進一步探明。

貓爪草的采收期通常為5月上旬，本試驗中17個產地貓爪草多糖含量的平均值的80%為23.25%。多糖含量是否與采收時間、地域、氣候、土壤環境、生長年限、種植方式等有關，有待進一步研究。