TCT、HPV-DNA聯合P16、Ki67檢測在宮頸癌前病變與宮頸癌診斷中的應用研究*

李萱 于海勝 劉穎群 方義湖

宮頸癌發病率僅次于乳腺癌，是婦科臨床中常見的惡性腫瘤之一，全球范圍內，每年死于宮頸癌約有20 多萬女性，而我國每年新發宮頸癌約13 萬例，死于宮頸癌約3 萬例，危害性極大[1-3]。宮頸癌的發生是一個從異型增生到原位癌，最后發展為浸潤性癌的漸進過程，有一個較長的、可逆轉的癌前病變期，早期宮頸癌患者5 年存活率高達90%[4-5]。若能讓早期準確篩查宮頸癌前病變及宮頸癌，盡早實施針對性的措施，對提高患者生存率及延長生存期至關重要。高危型人乳頭瘤病毒DNA（HPV-DNA）、薄層液基細胞學檢查（TCT）是早期篩查宮頸癌的有效手段，但存在一定的假陰性率或漏診率，診斷準確性欠佳。相關研究顯示，增殖細胞核抗原Ki67 與腫瘤抑制基因P16 與宮頸癌發生、進展密切相關[6-7]。為此，本研究旨在分析TCT、HPV-DNA 聯合P16、Ki67 檢測在宮頸癌前病變及宮頸癌診斷中的應用價值。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014 年12 月-2016 年12 月在本院婦科門診就診且自愿接受早期宮頸癌篩查的成年女性1 024 例，年齡18～58 歲，平均（38.21±2.36）歲。受檢者因體檢、性生活出血、白帶異常、陰道不規則出血等就診，無子宮切除、CIN 及宮頸癌病史且非妊娠期。

1.2 方法

1.2.1 TCT 用特質的細胞毛刷采集宮頸脫落細胞，將宮頸移行帶區脫落細胞洗入盛有保存液的小瓶中，離心沉淀處理后，提取細胞，制備成單層細胞涂片，直徑為13 mm，隨后行固定、巴氏染色，用細胞涂片離心機檢測系統檢測。以TBS 分級實施細胞學診斷。TCT 診斷結果：無上皮內瘤變（NILM），正?；蜓装Y，非典型鱗狀細胞（ASC，包括ASCUS 與ASC-H 兩類），低度鱗狀上皮內病變（LSIL），高度鱗狀上皮內病變（HSIL），鱗狀細胞癌（SCC）。其 中，LSIL 即CINⅠ，HSIL 即CINⅡ、CINⅢ。ASC-US 及以上病變定為TCT 結果陽性。

1.2.2 HPV-DNA 用基因芯片法檢測標本中HPV基因及其分型，高危型HPV 包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82 等基因。檢測出高危型HPV 為陽性。

1.2.3 陰道鏡下病理活檢 對HPV-DNA 或TCT 陽性患者，陰道鏡下取有白色病變、腺體開口、鑲嵌、異型血管等可疑病變進行病理學活檢檢查，若鏡下圖像不滿意或未發現異常，則常規在移行帶3、6、9、12 點四處活檢。病理診斷結果包括正?；蜓装Y、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸癌。

1.2.4 P16、Ki67 在陰道鏡下取宮頸活體組織，使用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，連續切片，切片厚度為4 μm，以免疫組化染色法進行P16、Ki67 染色。P16 以細胞漿或/和細胞核出現黃色或棕黃色顆粒為陽性。在400 倍高倍顯微鏡下，每張切片隨機選擇5 個視野，計數陽性細胞的百分數，結果取平均值。（-）：陽性細胞為0～5%；（+）：陽性細胞為5%～25%；（++）：陽性細胞為26%～75%；（+++）：陽性細胞＞75%。Ki67 以細胞核棕黃色為陽性，陰性：陽性表達局限于上皮的基底層，（+）：超過基底層10%～25%；（++）：超過26%～75%；（+++）：超過＞75%。

1.3 觀察指標 （1）分析HPV-DNA、TCT 檢測情況，兩項結果有一項為陽性行陰道鏡下病理活檢，以病理診斷結果為金標準，分析HPV-DNA、TCT單一與聯合診斷宮頸病變準確率差異。HPV-DNA、TCT 任意一項為陽性，則聯合診斷結果評定為陽性。（2）分析P16、Ki67 表達情況。

1.4 統計學處理 采用SPSS 21.0 軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（）表示，組間比較采用t 檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HPV-DNA、TCT 單一與聯合診斷宮頸病變效能 1 024 例女性經HPV-DNA、TCT 檢查，各篩出陽性例數178 例（17.38%）、164 例（16.02%），HPV-DNA、TCT 結果有一項為陽性者232 例（22.66%），對232 例患者行陰道鏡下病理活檢確診為陽性78 例（7.62%），LSIL 34 例（3.32%），HSIL 37 例（3.61%），宮頸癌7 例（0.68%），其余154例（15.04%）為宮頸炎。TCT 聯合HPV-DNA 檢查與病理活檢結果一致性較高，與HPV-DNA、TCT單一檢查相比，差異均有統計學意義（χ2=7.929、7.167，P=0.005、0.007）。見表1。

表1 HPV-DNA、TCT單一與聯合診斷宮頸病變結果 例（%）

2.2 P16、Ki67 表達情況 宮頸組織中隨著CIN 分期增加，P16、Ki67 陽性表達率逐漸升高，見表2。

表2 P16、Ki67表達情況 例（%）

表2（續）

3 討論

因宮頸癌早期無典型臨床表現，大部分患者被確診時已進展為中晚期，錯失手術治療最佳時機，預后較差，是造成女性死亡的因素之一[8-10]。宮頸癌發生與宮頸感染HPV 病毒密切相關，高危型HPV 感染是宮頸癌與癌前病變發生的必要先決條件[11-13]。故臨床常用HPV-DNA 篩查宮頸癌，但因其檢測步驟過于繁瑣且重現性欠佳，假陰性較高。TCT 是結合現代計算機技術與物理技術實施診斷的細胞學檢測新技術，能使制成的薄層涂片細胞結構更加清晰、成分更為齊全且背景更干凈，提升陽性診斷率。但在臨床診斷中發現，其漏診率較高[14-16]。本研究中，TCT 聯合HPV-DNA 檢查與病理活檢結果一致性較高，與HPV-DNA、TCT 單一檢查相比，差異均有統計學意義（P＜0.05）。提示聯合診斷可優勢互補，提高宮頸病變檢出率。

宮頸癌形成、轉移、浸潤是極為復雜的病變過程，與多種抑癌基因與癌基因的調控、表達和細胞凋亡密切相關[17]。P16 屬于細胞周期抑制因子，其表達產物P16 蛋白是CDK6 和CDK4 的抑制劑，能負調控細胞周期，抑制細胞惡變過度增殖[18-19]。但P16基因突變、缺失、啟動子高甲基化可誘發Cyclin D1-CDK4/6-pRb-E2F 通路調節功能失控，促使細胞過度增殖，進而導致患者出現腫瘤。Ki67 是一種具有維持細胞增殖作用的抗原，其表達水平可直接反映細胞增殖活性，是判斷腫瘤惡性程度和預后的重要指標[20]。本研究結果顯示，宮頸組織中隨著CIN 分期增加P16、Ki67 陽性表達率逐漸升高，提示P16、Ki67 與宮頸癌的發生、進展密切相關。

綜上所述，TCT 聯合HPV-DNA 檢查可有效鑒別診斷宮頸癌前病變及宮頸癌，且P16、Ki67 與宮頸癌前病變及宮頸癌發生、進展密切相關，可將其作為診斷宮頸病變手段，為早期診斷宮頸癌提供新思路。