納米銀粒子在牙本質樹脂粘接材料中抗菌活性的研究*

林苑云 黎江 馮盈

樹脂是一種高分子材料，可在室溫下快速固化，是口腔科牙體保存與修復治療中常用的粘接材料。牙本質是樹脂修復常見粘接界面，近年隨著第七代粘接劑的研發與使用，其與修復體的粘接效果得到明顯提升[1]，但受老化等因素影響，部分以樹脂粘接處理的牙本質，存在粘接面微滲漏的問題，可導致繼發齲，是造成樹脂填充或修復失敗的重要原因[2]。因此，有必要賦予牙本質樹脂粘接材料抗菌特性，以延長修復體使用壽命。納米銀就是將粒徑做到納米級的金屬銀單質，對多種微生物具有抑制和殺滅作用，是目前廣泛使用的無機抗菌劑[3]。文章現對納米銀粒子用于牙本質樹脂粘接材料中的體外抗菌效果進行研究，現報道如下。

1 器材與方法

1.1 儀器材料 超凈工作臺（上海凈化設備廠），分析天平（上海浦春），DYHS-70I 恒溫恒濕培養箱（廈門德儀），微量加樣器（日本Nichikyo），高壓蒸汽滅菌鍋（日本松下），Vitek 細菌比濁儀（法國梅里埃），牙本質樹脂粘接材料（上海齒科材料廠），納米銀粉（平均粒徑20 nm），沙氏瓊脂培養基（青島日水生物科技），乳酸桿菌（ATCC393），變形鏈球菌（ATCC25175），牙齦卟啉單胞菌（ATCC25261），白色念珠菌（ATCC10231），粘性放線菌（ATCC19246），另有SiC 水磨砂紙、PE 膜、麥氏比濁液、培養皿、玻璃板等。

1.2 方法

1.2.1 制備含納米銀粒子牙本質粘接樹脂 常溫條件下，取適量牙本質粘接樹脂材料，分成8 份，分析天平精準稱取納米銀粒子，加入其中7 份樣本中，避光條件下充分攪拌30 min，使均勻混合，制備成納米銀粒子質量百分比分別為0（未添加）、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0% 的牙本質粘接樹脂試件。將0 的試件設為陰性對照組，7 組不同質量百分比的納米銀粒子牙本質粘接樹脂試件依次設為實驗1、2、3、4、5、6、7 組。

1.2.2 制備含納米銀粒子牙本質粘接樹脂片 含納米銀粒子牙本質粘接樹脂制備完成后，取規格為4 mm×4 mm×1 mm 的模具，模具內面以聚乙烯薄膜纏繞，填充滿制備的復合樹脂，置于玻璃板上水平按壓5 min 后取出，完成樹脂片制備。砂紙拋光去除樹脂片表面層，使大小一致、形狀規整，每組各制作15 個樹脂片，供3 次檢測使用。樹脂片24 ℃蒸餾水中浸泡24 h，妥善保存并標記備用，防止混淆。

1.2.3 菌液配置 取各菌種凍干菌試管，滴加沙氏培養液，充分混勻，取2 mL 菌懸液，接種于培養基，37 ℃恒溫培養24 h，后以接種環取培養后的菌懸液，連續轉接2 次，完成細菌活化。取末次轉接后的新鮮細菌培養物，采用麥氏比濁法制成1×105CFU/mL菌懸液，操作全程嚴格無菌化。

1.2.4 抗菌實驗 將試件置于無菌玻璃皿中，取稀釋后的各菌懸液，分別滴加在每組試件上，每個試件各滴加0.1 mL，保證試件的各面均浸在菌懸液中，以消毒過的PE 膜覆蓋，37 ℃恒溫培養24 h，其中白色念珠菌、粘性放線菌需氧培養，變形鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌、乳酸桿菌厭氧培養。培養完成后，玻璃皿中加10 mL 0.9%無菌氯化鈉水溶液，上振蕩器高頻振蕩60 s，充分洗脫試件和PE 膜上的細菌。取洗脫液，10 倍遞增法稀釋至1×10-2，取樣100 μL 接種，同法培養24 h。

1.2.5 抗菌率檢測 統計各組試件活菌數，檢測參照國標4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗 菌落總數測定》相關標準，每組各檢測3 次，取平均值。計算各實驗組不同濃度納米銀粒子抗菌率，評價抗菌活性。計算公式：抗菌率=（陰性對照試件回收菌數-實驗組對照試件回收菌數）/陰性對照試件回收菌數×100%?？咕试礁?，抗菌活性越強。

1.3 統計學處理 采用SPSS 21.0 軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（）表示，比較采用t 檢驗；三組及以上的組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t 檢驗。計數資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同組別試件表面菌落數統計 經檢測，實驗1～7 組試件表面5 種細菌的菌落數均顯著低于陰性對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05），且隨著納米銀粒子質量百分比的增加，實驗1～7 組試件表面菌落數均呈遞減趨勢，各組間比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2 不同組別試件抗菌率統計 經計算，除實驗3組牙齦卟啉單胞菌的抗菌率達90.44%以外，實驗1～3 組5 種細菌的抗菌率均未超過90%，抗菌效果一般，但實驗2、3 組抗菌率較實驗1 組均有改善，差異均有統計學意義（P＜0.05）。實驗4 組5 種細菌抗菌率均達90%，抗菌性強。實驗5～7 組5 種細菌的抗菌率均超過98%，抗菌性極強，且雖然隨著納米銀粒子質量百分比的增加，實驗5～7 組的抗菌率有所上升，但組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表1 不同組別試件表面菌落數統計[CFU/cm2，（）]

表1 不同組別試件表面菌落數統計[CFU/cm2，（）]

*與陰性對照組比較，P＜0.05。

表2 不同組別試件抗菌率統計[%，（）]

表2 不同組別試件抗菌率統計[%，（）]

*與實驗1 組比較，P＜0.05。

3 討論

銀是具有抗菌能力的金屬，可以抑制微生物生長繁殖，特別是借助前沿納米技術將銀納米化所形成的納米銀粒子，目前已被廣泛作為無機抗菌劑使用[4-7]。主要抗菌機制：（1）銀粒子帶有正電荷，可以穿透細菌的細胞壁進入帶有負電荷的細胞膜內，兩者接觸后發生巰基反應，會破壞細菌固有成分，使蛋白質凝固及酶滅活，或使細菌產生功能性障礙，造成細胞分裂增殖能力喪失，從而達到抗菌的效果；（2）銀粒子能夠與細菌體內的氧代謝酶（-SH）結合，使細菌窒息死亡；（3）銀粒子還能通過破壞細菌呼吸系統與物質傳輸系統、損傷細菌細胞膜、抑制細菌蛋白質等機制發揮殺菌滅菌的作用。而當細菌失去活性后，細胞膜負電荷消失，菌體內的銀離子會游離出來，繼續與其他活菌結合，重復殺菌活動[8-9]。因此，與傳統不穩定的有機滅菌劑相比，銀的抗菌效果更為持久，且無任何毒性反應、刺激反應與耐藥性，安全無傷害，用于醫療材料領域優勢諸多[10-12]。

有研究顯示，納米銀粒子抗菌效果極強，可在數分鐘內殺死細菌，而且抗菌譜廣，對耐藥病原菌也具有全面抗菌活性，已知可殺死的細菌種類超過650 種，幾乎涵蓋臨床常見致病菌[13-15]。有學者在研究中證實，質量百分比為0.5%的納米銀粒子即可發揮明顯的抑菌效果，可以有效抑制粘接材料細菌生長[16-17]。另有研究顯示，將納米銀摻入到樹脂粘接材料中，制成質量百分比為0.6%的復合材料，可以明顯抑制齲菌生長，且不會對樹脂材料的機械性能造成明顯影響[18]。本次研究結果顯示，實驗1～7 組試件表面5 種細菌的菌落數均顯著低于陰性對照組（P＜0.05），提示牙本質樹脂粘接材料中加入質量百分比為0.5%的納米銀粒子，即可明顯抑制細菌產生。從理論上講，隨著納米銀添加比的增高，單位面積樹脂材料上銀粒子越多，抗菌效果越強，這在本研究中也得到了證實。實驗1～7 組隨著納米銀質量百分比的增加，抗菌率呈增高趨勢，特別是當質量百分數達3.0%時，5 種細菌抗菌率達98.0%，展現出了極強的抗菌活性，且與更高質量百分數的納米銀樹脂粘接材料抗菌率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。因此，單從抗菌角度來看，建議將3.0%作為納米銀粒子最佳添加比。不過，樹脂材料不同，納米銀粒子的抗菌活性可能存在差異，而且納米銀粒子添加越多，材料成本越高，還可能對材料的硬度、韌性、耐磨性、抗熱震性等物理性能產生影響，可能導致生物安全性降低[19-20]。因此，牙本質樹脂粘接材料添加納米銀粒子具體適宜的量，應綜合考慮抗菌活性、物理性能、材料成本等多因素，以達到最佳性價比。