ELISA聯合NAT技術在獻血者血液篩查和輸血殘余風險分析中的應用

陳紅霞

廣東省惠州市中心血站(惠州 516003)

臨床用血主要來源于獻血，獻血者的血液篩查對于保證用血安全具有重要意義，采取科學的血液篩查方法能夠降低輸血殘余風險[1]。目前獻血者的血液篩查主要采用兩次酶聯免疫法(ELISA)檢測，但是因為乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、艾滋病毒(HIV)等感染存在一定窗口期或病毒變異、免疫靜默等，易導致部分病毒感染者ELISA檢測結果呈陰性，造成病毒漏檢、漏診，影響臨床輸血安全，存在輸血殘余風險[2]。核酸檢測技術(NAT)是近年來應用于臨床中的一種病毒核酸篩查方法，能在人體感染HBV、HCV、HIV后短期內檢測出血液標本中含量極少的病毒DNA[3]，能在最大程度上縮短病毒檢測的“窗口期”，彌補ELISA檢測方法的不足[4]。2015年我國《血站技術操作規程》[5]推薦將ELISA、NAT聯合應用，為提升獻血者血液篩查準確性奠定基礎。作為醫療機構的血液供應單位，面臨患者用血安全問題，更應支持兩種方法的“雙保險”檢測。本次選取我中心血站2 514例無償獻血者的血液標本分別采用ELISA、NAT技術檢測，分析ELISA、NAT技術聯合應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究選取2019年1月—8月惠州市中心血站2 514例無償獻血者為研究對象，其中男1 305例，女1 209例；年齡18～57歲，平均(29.31±4.57)歲。所有獻血者均經《獻血者健康檢查要求》(準GB 18467- 2011)[6]中的相關規定進行初篩，符合獻血標準后獻血。

1.2 檢測方法

平行采集每位獻血者2管血液，各5 mL，1管以EDTA-K3真空抗凝管保存，作為ELISA檢測標本，1管以EDTA-K2真空抗凝管保存，作為NAT技術檢測標本，均在2 ℃～8 ℃環境中保存，并于3 h內做離心處理、24 h內完成檢測。

1.2.1 ELISA法檢測 以ELISA法檢測乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、丙肝抗體(抗-HCV)、艾滋病抗體(抗-HIV)，檢測方法及步驟嚴格遵循衛生部門相關規定。分別應用不同廠家的試劑盒重復檢驗2次，試劑盒來源(見表1)。檢驗前先做HBsAg膠體金快速篩查以減少血液報廢，合格后再采血、留樣。ELISA法檢測前，使用全自動加樣機加樣、設置陰性對照和陽性對照、確定標準質控品，并以一次性加樣尖加樣；使用全自動酶免分析儀檢測進行后處理，所有試劑都應用掃描條形碼方式。陽性判定標準：①兩個商家的試劑盒檢測均為陽性；②一個試劑盒檢測為陽性，再次用此種試劑進行雙孔復測試管仍然有≥1孔為陽性。其中HBsAg、抗-HCV 80%灰區為陽性，抗-HIV70%灰區為陽性。

表1 ELISA檢測試劑盒

1.2.2 NAT技術檢測 具體檢測步驟如下：①以磁珠捕獲技術制備樣本，分離HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA；②做逆轉錄處理，將RNA轉化為互補DNA(cDNA)；③以聚合酶鏈反應(PCR)擴增、特異性熒光探針檢測cDNA；④根據反應管中熒光信號達到預先設定域值時的循環閾值(Ct)判定結果，Ct<40為陽性，Ct≥55為陰性，Ct為40～50需要重新測量。

1.2.3 標本追蹤 ELISA檢測陰性，而NAT檢測陽性者，再次采集血樣檢測HBsAg、抗-HCV、抗-HIV，并于第1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d進行采樣追蹤，檢測HBsAg、抗-HCV、抗-HIV。

1.3 觀察指標

分別統計ELISA檢測、NAT技術檢測結果，將ELISA檢測結果與ELISA聯合NAT技術檢測結果進行對照分析。

2 結 果

2.1 ELISA檢測結果

ELISA檢測結果顯示27例陽性，陽性率1.07%，其中2例同時HBsAg陽性、抗-HCV陽性。HBsAg陽性率0.52%，抗-HCV陽性率0.36%，抗-HIV陽性0.28%。見表2。

表2 ELISA檢測結果 n=2 514

2.2 NAT技術檢測結果

NAT技術檢測結果顯示12例陽性，陽性率0.48%，其中1例同時HBV DNA陽性、HCV RNA陽性。HBV DNA陽性率0.28%，HCV RNA陽性率0.16%，HIV RNA陽性率0.08%。見表3。

表3 NAT技術檢測結果 n=2 514

2.3 ELISA與NAT檢測結果對比

27例ELISA檢測陽性中，10例經NAT技術檢測證實為陽性，17例為陰性；2 487例ELISA檢測陰性中，2例NAT技術檢測HBV DNA陽性，2 485例為陰性。見表4。

對2例ELISA檢測檢測陰性、NAT技術檢測陽性者重新采集血樣再次檢測HbsAg仍為陰性，進行隨訪追蹤，其中1例追蹤至第7d HbsAg陽性，另1例追蹤至28 d HbsAg陽性，證實為窗口期HBV感染。以ELISA聯合NAT技術為標準，2次ELISA檢測的敏感度為83.33%(10/12)，特異度為99.32%(2 485/2 502)，檢測總準確性為99.24%(2 495/2 514)。

表4 ELISA與NAT檢測結果對比

3 討 論

提升獻血者血液篩查質量是提升用血安全、降低輸血殘余風險的基礎。以往多采用ELISA進行血液篩查，2015年我國《血站技術操作規程》[5]推薦將ELISA、NAT聯合應用，然而此種血液篩查方式并未得到推廣應用。2次ELISA篩查仍然存在漏檢、誤檢風險，存在輸血殘余風險，面對該問題[7]，應該強化ELISA與NAT的聯合應用研究，為提升獻血者血液篩查準確性奠定基礎。

本次研究結果顯示ELISA檢測陽性率為1.07%，而NAT技術檢測結陽性率為0.48%。在2次ELISA檢測基礎上進行NAT檢測，發現ELISA檢測存在漏診、誤診，其中17例為誤診，2例為漏診。由此判斷在獻血者血液篩查中應用2次ELISA檢測也存在漏診、誤診風險，仍有輸血殘余風險，可能經輸血傳播乙肝、丙肝、艾滋病[8]。因此，有必要進一步提升獻血者血液篩查準確性、降低輸血殘余風險。ELISA檢測以血液標本中的抗體和抗原為對象進行血液分析，無需對血液標本進行處理，以抗原-抗體反應識別判定結果。但是抗原、抗體形成時間較長，該時期被稱為病毒窗口期，窗口期病毒不能通過抗原、抗體檢測出[9]。因此ELISA檢測存在明顯不足，據統計窗口期病毒是導致ELISA檢測當中HBV、HIV漏診的主要原因。本次研究中2例研究對象的血液標本ELISA檢測陰性，NAT技術檢測陽性，最終經隨訪追蹤檢查證實HbsAg陽性，為窗口期HBV感染，也證實ELISA檢測會漏診窗口期病毒感染[10]。NAT技術[11]是將血液中的病原體核酸作為檢測對象，能夠縮短窗口期，可以在病毒侵入人體早期發現病毒，能夠彌補ELISA法在窗口期病毒感染中篩查中的不足。而窗口期的病毒載量很高，具有極強的傳染性，NAT技術準確檢測出窗口期的病毒感染能夠提升用血安全性、降低輸血殘余風險[12]。本次研究中在2次ELISA檢測后進行NAT技術檢測，發現17例為誤診、2例為漏診，進一步提升了血液篩查質量，降低了輸血殘余風險，提升了用血安全性。但NAT技術也存在自身不足，其操作步驟繁瑣，耗時長、容易造成污染，盡管近年來二氧化硅、玻璃粉、硅藻及自動化設備的應用都極大的提升了核酸的提取速率，簡化了檢測步驟，但所需時間仍然較長[13]。

上述研究分析可知ELISA法、NAT技術在獻血者血液篩查當中均具有自身優勢和不足，兩者具有互補性，應聯合應用。其互補性具體體現如下：①病理生理過程互補：ELISA法檢測具有較長的“窗口期”，容易發生漏診，而NAT技術檢測窗口期病毒的時間較短，且因為機體的保護性抗體還沒有產生，病毒載量很高，具有高傳染性，NAT技術檢測能夠通過減小窗口期提升用血安全性[14]。②受治療藥物影響不同：NAT技術檢測對于治療后轉陰的獻血者血液標本不敏感，如在應用拉米夫定、干擾素治療后一些患者的NAT技術檢測結果轉陰，而ELISA法檢測仍為陽性，盡管此種現象少見，但也證實兩種檢測方法具有互補性。

需要指出的是本次研究中NAT技術僅檢測出2例ELISA檢查HBV漏診者，但未發現HCV、HIV漏診者，這可能與本次研究中HCV、HIV感染樣本量少有關，不能說明HCV、HIV無窗口期，也不能說明ELISA檢查對于HCV、HIV無漏診。對此今后仍需針對HBV、HCV、HIV展開分別研究分析。

本次研究證實對獻血者血液進行2次ELISA篩查仍然存在漏檢風險，聯合應用NAT技術能夠提升獻血者血液篩查準確性，降低輸血殘余風險，保證用血安全。但是NAT技術并不能完全消除HBV、HCV、HIV的輸血感染風險，因此不能取代ELISA單獨應用。臨床當中應聯合應用ELISA、NAT技術，建立科學的血液病毒篩查系統，最大限度降低輸血殘余風險，保證用血安全。