HPLC法測定銀黃甘顆粒中金銀花有效成分綠原酸的含量

鄭雪媚

摘 要：目的：采用HPLC法測銀黃甘顆粒中金銀花有效成分綠原酸的含量。方法：測定色譜條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（5u4.6×250mm），以乙腈-0.4%磷酸溶液（10∶90）為流動相，檢測波長為327nm。結果：綠原酸在20～250?g/mL范圍內線性關系良好，相關系數R2為0.9999;綠原酸的回收率為99.3%～100.5%;綠原酸的測定重復性RSD為0.3%。結論：該方法線性范圍寬，分析時間短，樣品前處理簡便，定量結果準確，重現性好。

關鍵詞：綠原酸;銀黃甘顆粒;HPLC;含量測定

Abstract： Objective：HPLC determination of chlorogenic acid which is the effective component of honeysuckle in Yinhuanggan Granules. Methods：Determination of chromatographic conditions：column as C18（5u 4.6×250mm），mobile phase as acetonitrile -0.4%Phosphoric acid solution（10∶90，v/v），detection wavelength of 327nm.Results：chlorogenic acid showed a good linear relationship at range of 20～250μg/mL（R2=0.9999）.The recovery rate of chlorogenic acid was 99.3% to 100.5%.The RSD chlorogenic acid was 0.3% .Conclusion：This method showed a wide linear range of the determination，a short analysis time，simple pre-treatment of samples，quantitative results and a good reproducibility.

Key words： Chlorogenic acid; Yinhuanggan Granules; HPLC; Determination of content

金銀花含有綠原酸、異綠原酸、木犀草素、咖啡酰奎寧酸類等主要活性成分，主要藥理作用在于：（1）抗炎作用。王林青等研究發現，金銀花的提取物對于大鼠局部急性炎癥有較好的抑制作用[1]。崔曉燕等研究表明，金銀花有效成分能夠顯著抑制大鼠原代小膠質細胞NO釋放，說明其具有抗炎作用[2]。宋建華研究表明，金銀花對炎癥模型小鼠的抗炎作用與其劑量呈明顯正相關性[3]。（2）抗菌作用。趙良忠等實驗顯示，金銀花能抑制金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌的繁殖，說明金銀花提取物具有較好抗菌作用[4]。金銀花主要成分綠原酸、異綠原酸、木犀草素均有抑制銅綠假單胞菌的效果，抑制效果最強的是綠原酸;金銀花有機酸組分與氨基糖苷類抗生素聯合用藥，能協同抑制銅綠假單胞菌多耐藥菌株[5]。李平等研究顯示，金銀花對金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌有不同程度的抑菌效果[6]。李國喜等實驗研究發現，金銀花不同濃度水提液可以有效治療人工感染雞大腸桿菌病[7]。（3）抗病毒作用。馬雙成研究發現，金銀花對呼吸道病毒有較強的抑制作用，其中綠原酸和咖啡酰奎寧酸類是其抗呼吸道病毒作用的主要活性物質[8]。李永梅研究發現，金銀花醇提取液能增強細胞抗病毒感染的能力，其抗病毒效果顯著[9]。此外，季志平等研究表明，金銀花能降低病毒感染小鼠的肺指數值，且明顯減輕感染實驗動物的肺部病變[10]。（4）抗支原體作用。孫艷平等研究發現，金銀花水提物具有明顯抗肺炎支原體作用[11]。（5）免疫功能調節。周秀萍等研究發現，金銀花水煎劑能明顯提高巨吞噬細胞吞噬率及吞噬指數，其量增加時，機體的淋巴細胞轉化率增強[12]。王妍實驗研究證明，金銀花水煎液可提高小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能，同時也能促進小鼠淋巴細胞的轉化，表明金銀花具有明顯免疫調節作用[13]。

本研究按照中國獸藥典要求[14]，根據綠原酸的結構特點，建立測銀黃甘顆粒中綠原酸含量的HPLC法。該方法具有線性范圍寬、分析時間短、樣品前處理簡便、定量結果準確、重現性好等優點，可為銀黃甘顆粒的質量控制提供依據。

1 研究方法

1.1 試劑與儀器 日本島津SPD-20A液相色譜儀;柱溫箱CTO-20AC;超純水儀UPR-5T;超聲波清洗器KQ-500DE;天平METTLER MS105DU;綠原酸標準品來源：中國食品藥品檢定研究院;水為超純水，乙腈為色譜純。

1.2 色譜條件 流動相：乙腈-0.4%磷酸溶液（10∶90），色譜柱：菲羅門C18 5u4.6×250mm，檢測波長：327nm，流速：1.0mL/min，柱溫：35℃，進樣量：10?L。

1.3 對照品溶液的配制 稀釋液：流動相。對照儲備液：精密稱取綠原酸對照品51.9mg，置100mL棕色量瓶中，加50%甲醇使溶解至刻度，搖勻，作為綠原酸對照品貯備液。取對照儲備液1.0mL到10mL容量瓶中，加稀釋液定容，制成約51.9?g/mL的對照液。

1.4 樣品溶液的配制 取銀黃甘顆粒適量，研細，取約0.5g，精密稱定，置50mL棕色量瓶中，加50%甲醇40mL，超聲處理（功率500W，頻率40kHz）30min，放冷，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

1.5 系統適用性試驗 取上述51.9?g/mL的對照溶液10?L分別按1.2。色譜條件下進樣，測定并計算柱效、分離度和拖尾因子（具體數據見表1）。

1.6 線性試驗 取上述對照儲備溶液分別稀釋成20.05?g/mL、50.14?g/mL、100.27?g/mL、150.41?g/mL、200.54?g/mL、250.68?g/mL的系列對照品溶液，按1.2色譜條件測定，以峰面積對濃度進行回歸，綠原酸峰面積的回歸方程分別為：Y=27136X-102920（R5=0.9999），說明綠原酸在20～250?g/mL范圍內具有良好的線性關系（具體見圖1）。

1.7 重復性試驗 精密吸取同一供試品溶液，按1.2項色譜條件測定，進樣6次，得綠原酸峰面積的RSD為0.3%，表明樣品的重復性良好。具體如表2所示。

1.8 回收率試驗 精密取已知含量的同一批樣品（含量為5.1mg/g）約0.25g（共9份）置于50mL容量瓶中，分別加入上述1.3.2項下對照儲備液1.5mL、2.5mL、3.5mL，按上述1.4項要求處理，進樣測定。樣品綠原酸的平均回收率為99.9%。具體結果見表3。

1.9 供試品的測定 取3批樣品及標準溶液，按外標法測定，每批樣品進樣2次，計算樣品中綠原酸含量（圖譜見圖2）。3批樣品的含量測定結果分別為4.9mg/g、4.7mg/g、5.0mg/g。

2 結論

本試驗建立了HPLC法測銀黃甘顆粒中綠原酸含量的方法，測定色譜條件為：色譜柱為菲羅門C18 5u4.6×250mm，流動相為乙腈-0.4%磷酸溶液（10∶90），流速為1.0mL/min，檢測波長為327nm，在20～250?g/mL范圍內線性關系良好。該方法具有線性范圍寬、分析時間短、樣品前處理簡便、定量結果準確、重現性好等特點，為其質量控制提供科學依據。

參考文獻

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[14]中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典（二部）[S]北京：中國農業出版社，2015. （責編：張宏民）