西藏2種烏頭屬藥用植物莖內內生菌的分離與鑒定

馬紅梅 王璐璐 段雙全

摘 要：目的：探究西藏工布烏頭和露蕊烏頭2種藥用植物植株莖內內生菌。方法：采用培養基培養法和載玻片法對分離得到的菌株進行形態學分析，并利用分子生物學技術提取菌株DNA進行測定。結果：從2種西藏烏頭屬藥用植物中獲得的2株菌株，均屬于半知菌亞門曲霉屬環繞亞屬黑色組的真菌。

關鍵詞：西藏;藥用植物;內生菌;DNA;烏頭屬

Abstract：Objective：This paper mainly explores the Isolation and identification of endophyte? in medicinal plant of Aconitum in Tibet. Methods：The strains of endophyte were isolated and analyzed morphologically by medium culture method and slide method. DNA of each strain was extracted by molecular biology technology for determination. Results：The two strains obtained belonged to the black fungus group of Aspergillus，Monilia-ceous，Hyphomycetales，Hyphomycetes，Deuteromycotina.

Key words：Tibet;Medicinal plants;Endophytes;DNA;Aconitum

內生菌（Endophyte）一詞最早是由德國科學家de Bary首先提出的，早期定義是指生活在植物組織內的微生物。在長期的研究過程中，由于不同科研工作者研究的植物、角度、目的及得到的結論不盡相同，因此“內生菌”的概念和解釋被多次修改。截至目前，普遍被認可的“內生菌”的概念是指生活史中某一時期生活在植物體內而其本身對植物組織不會引起明顯病害癥狀的微生物類群。一般認為，植物內生菌與宿主互惠共生、協同進化。

近年來，隨著生態學及醫學研究的不斷深入，國內外專家學者及相關的科研工作者對植物內生菌的研究越來越多。大量研究表明：植物內生菌在植物生命過程中起著十分重要的作用，主要體現在對植物的生長發育、次生代謝、應對生物脅迫等方面具有重要的作用[1]。目前，關于植物內生菌的研究已經滲透到醫學、中藥學、生態學、微生物學、植物病理學等多個學科領域。自Vogl于1898年成功從黑麥草（Lolium tu-melentum）的種子中分離得到第1株內生真菌以來[2]，已有很多研究者從不同植物中分離得到了不同種類的植物內生菌。眾多的研究成果不僅豐富了內生菌種類，更加深了人們對內生菌的認識。目前，關于植物內生菌的研究和報道較多的是從不同植物內生菌內發現一些具有天然活性的代謝產物，主要包括萜類、黃酮類、內酯類、酚類、多肽類等[3，4]。可見，植物內生菌作為一種重要的微生物資源，是新型天然活性物質的重要來源之一。

西藏植物資源豐富，尤其是藥用植物，其中烏頭屬植物在我國作為藥材的應用已有很長的歷史。據文獻記載，烏頭屬植物的主要化學成分是烏頭堿，并含有多糖、香豆素、黃酮、甾體等化學成分，具有調節免疫、麻醉止痛、抗炎和抗腫瘤等多重功效[5]。西藏現有烏頭屬植物73種，占全國烏頭屬植物總種數（含變種）的20.50%;該屬資源的豐富度在全國范圍內僅次于四川和云南，其中較明確的藥用種類有13種，占西藏烏頭屬植物總種數的17.81%[6]。西藏烏頭屬植物主要分布在海拔2000～5000m的高山草甸、山坡石隙、礫石草坡和灌木叢林等地[7]。

目前，關于烏頭屬藏藥研究較多的是在其化學成分及其結構以及生理活性等方面，尚未見對其內生菌的相關研究報道。植物內生菌按其種類一般分為內生細菌、內生真菌及內生放線菌3類。為探明西藏烏頭屬植物體內內生菌的存在及分類，本試驗對西藏2種常見的烏頭屬植物工布烏頭和露蕊烏頭莖內內生菌進行了分離與鑒定，以期為今后該屬植物資源的保護及烏頭屬藏藥的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 實驗樣品 工布烏頭和露蕊烏頭屬于毛茛目、毛茛科（Crassulaceae）、烏頭屬（Rhodio-la L.）的植物[8]。工布烏頭和露蕊烏頭植株，均采自西藏林芝市工布江達縣米拉山東坡，海拔4410m（北緯29°53′6″、東經92°20′19″）。

1.1.2 培養基及制備方法 采用PDA培養基（葡萄糖10g、土豆200g、瓊脂15g、蒸餾水），定容到1000mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理 取工布烏頭和露蕊烏頭的莖用自來水反復沖洗后，再用醫用消毒水沖洗數遍，放入無菌操作臺內滅菌30min。然后將植物的莖切成3～4cm的小段，再縱向切開放入盛有次氯酸鈉溶液的燒杯中15min，之后分別用硫代硫酸鈉、乙醇和無菌水進行沖洗[9]，置于PDA培養基中進行培養。

1.2.2 菌株的形態觀察 將分離得到的菌株移至新的培養基中進行分離純化，再將純化后的菌株以點接方式，接種到新的PDA培養基中。待觀察到培養基表面有菌絲生長時，用已滅菌的醫用手術刀把培養基切成長和寬為2cm×2cm，之后移到已經滅菌的載玻片上，蓋上蓋玻片繼續培養[10]，設置智能溫控培養箱的溫度為25℃，濕度為60%～80%的范圍內，每2d觀察1次孢子的發育情況。

1.3 純化后菌株的分子生物學研究

1.3.1 菌株DNA的提取 挑取真菌菌絲添加到PBS緩沖液中，加入100U的Lyticase（sigma L4025），于37℃條件下破壁處理30min。之后用真菌基因組DNA快速提取試劑盒（此試劑盒由寶信生物有限公司提供，貨號DN1112）提取基因組DNA，用于后續的基因擴增。

1.3.2 rRNA基因ITS區間片段的擴增 PCR反應體系（50μL）如表所示。

1.3.3 rRNA基因ITS區間片段序列的測定 人工配制1.2%的瓊脂糖DNA膠，用凝膠電泳鑒定得到的擴增產物，使條帶涌動，直至流動到適當位置時，找到在凝膠成像中的目的條帶，將目的條帶進行回收。DNA序列測序用的是回收到的目的條帶。

1.3.4 rRNA基因ITS區間片段的系統發育分析 將北京博邁德基因公司所測得的ITS序列通過互聯網提交到Genbank數據庫，運用BLAST進行網上在線比對，得到相似較高的序列，并將其作為參考序列進行序列號登記，運用Clustal_X2.0軟件進行比對。利用生物進化數據分析方法以及進化樹軟件對進化距離進行計算并建立系統發育的進化樹。

2 結果與分析

2.1 菌株形態 在25℃溫度條件下，工布烏頭和露蕊烏頭莖內均可分離得到黑色絨毛狀菌株，能在14d后在PDA培養基上迅速生長繁殖，經多次分離純化菌株，發現菌株菌落呈現黑色，其整體菌落形態較為疏松，且有較淡的霉味，經分析之所以散發出較淡的霉味，出現黑色粉末，是因為菌落表面有部分已經分化產生孢子，其分生孢子頭部為黑色，頂囊的形狀為球形或近球形，直徑為30～45μm;分生孢梗莖光滑無色，近頂囊處略帶有暗褐色;產孢結構為雙層，并呈現出褐色;平梗是（8～10）μm×L2.5～3μm，壁的粗糙程度很明顯，且具有不規則的脊狀凸起或縱向條紋。

2.2 菌株的系統發育樹 將工布烏頭和露蕊烏頭莖內提取得到的菌株的rRNA基因ITS區間序列提交到GenBank，得到登錄號分別為GB6961294和GB6961295。通過用BLAST在線對序列做相似性分析。對于無法用人工判定的高覆蓋率和高相似度比對結果，運用MEGA6.0和Clustal_X2.0軟件構建系統發育樹，得到菌株的聚類分析情況（見圖3）。從圖3可以看出，工布烏頭和露蕊烏頭內生菌菌株均歸類于曲霉屬環繞亞屬（D）中的黑色組（C），2種烏頭的內生菌菌株與黑曲霉親緣關系最為接近。

3 討論

本研究中，通過對采自西藏林芝市工布江達縣米拉山東坡的工布烏頭和露蕊烏頭2種藥用植物植株莖內內生菌的進行分離，得到菌株。通過查閱中國真菌志（第五卷）中相關內容得知，該菌株歸屬到曲霉屬黑色組真菌的一種。然而，在菌株瓶梗和梗基形態上的描述與模式物種有所差異。另外，通過查閱真菌超微形態[11]、中國菌物和普通真菌學等文獻，都將其列入曲霉屬真菌;通過rRNA基因ITS間隔區序列進行發育分析，進一步確立了菌株在系統發育上的進化位置，屬于曲霉屬環繞亞屬黑色組的一種真菌。本試驗結果對于補充西藏烏頭屬藥用植物內生菌的相關研究以及對藏藥植物資源的保護和利用具有一定的意義。

植物內生菌是一個巨大的微生物新資源，具有重要的醫藥應用潛力。西藏植物資源豐富，尤其是藥用植物資源豐富，生境特殊。因此，對西藏這種特殊生境下更多的藥用植物內生菌的研究，包括其他的烏頭屬藏藥植物內生菌的分離鑒定，可以為西藏新型藏藥的開發利用提供一定的參考。

參考文獻

[1]崔晉龍，郭順星，肖培根.內生菌于植物的互作關系及對藥用植物的影響[J].藥學學報，2017，52（2）：214-221.

[2]鄒文欣，譚仁祥.植物內生菌研究新進展[J].植物學報，2001，43（9）：881-892.

[3]華梅，肖支葉，原曉龍，等.10種植物內生真菌抗菌活性研究[J].福建師范大學學報（自然科學版），2018，34（2）：57-64.

[4]楊志軍，鄧毅，曼瓊，等.內生菌在天然藥物研究中的研究進展[J].中國臨床藥理學雜志，2018，34（5）：593-596.

[5]楊姝，金振輝，羊曉東，等.烏頭屬植物的化學成分及藥理作用研究進展[J].云南農業大學學報，2007，22（2）：293-295.

[6]馬景銳，薛輝，徐磊，等.西藏烏頭屬植物多樣性研究及應用[J].廣東農業科學，2015，20：26-33.

[7]中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M].北京：科學出版社，2004.

[8]吳征鎰.西藏植物志[M].北京：科學出版社，1983：16-32.

[9]赫曉娟.植物內生菌[M].北京：中國農業科學出版社，2010：53-54.

[10]林曉明，李振岐，侯軍，等.中國菌物[M].北京：中國農業出版社，2007.

[11]康振生，黃麗麗，李金玉.植物病原真菌超微形態[M].1版.北京：中國農業出版社，1997.

（責編：張宏民）