1株抗煙草青枯病菌拮抗菌的篩選及鑒定

王磊 王興蘭 郭瑞

摘 要：在黔南煙區煙草青枯病嚴重發病的田塊采集健康煙草根際土壤進行分離、純化和培養后共獲得35株細菌，通過抑菌圈法篩選出2株對煙草青枯病菌具有良好拮抗效果的菌株S3-1和S3-2，抑菌圈直徑分別為1.3cm和1.4cm，抗青枯病的模式菌FZB抑菌圈為1.3cm;通過對目標菌株S3-2開展16S rDNA序列測定，并對測序結果開展BLAST比對，初步鑒定出S3-2菌株屬于芽孢桿菌屬。

關鍵詞：煙草青枯病菌;根際細菌;拮抗菌;分子生物學鑒定

Abstract：Collecting healthy tobacco rhizosphere soil from fields with severe incidence of tobacco bacterial wilt in Qiannan tobacco area，35 strains of bacteria were obtained after isolation，purification，and cultivation. Two strains were screened out with good antagonistic effects against tobacco bacterial wilt by the inhibition zone method. The diameters of the inhibition zone of the strains S3-1 and S3-2 are 1.3cm and 1.4cm，respectively. The inhibition zone of bacterial wilt resistance model FZB is 1.3cm. By sequencing the 16S rDNA of the target strain S3-2 and comparing the sequencing results with BLAST，the strain S3-2 was preliminarily identified as bacillus.

Key words：Tobacco bacterial wilt;Rhizosphere bacteria;Antagonistic bacteria;Molecular biological identification

由青枯雷爾氏菌引起的細菌性土傳性病害煙草青枯病危害范圍廣泛，對我國煙草種植業造成了巨大的經濟損失[1]。通過篩選有效的生物防治細菌進行生物防治是一種安全無害且長效的方法[2]。微生物有機肥不僅可以降低青枯病的發病率，而且還能為煙株提供營養，改善土壤環境[3]。與常用的化學防治方法相比，生物防治具有成本低、效果持久以及無二次污染等優點[4]。畢濤[5]在山東煙區根際土壤中分離出3株具有最佳抑菌效果的菌株Cla、Tsb、C2c，經鑒定均為多粘類芽孢桿菌;董昆明等[6]從黔江煙區根際土壤中分離得到的5B18菌株經鑒定是解淀粉芽孢桿菌。由此可見，篩選抗性菌株對青枯病等病害進行生物防治是當前熱門的研究課題之一。本研究從發病田塊的健康煙草植株根際土壤樣品中篩選出2株對青枯病菌具有良好抗性的菌株，并進行分子生物學鑒定，以期為開發綠色生物肥料、防治病害、改良土壤環境提供物質支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 試驗所用的煙草青枯病病原菌來源于安徽農業大學植物病理實驗室，從黔南煙區的健康植株根際土壤中分離得到所需的煙草根際細菌。

1.1.2 培養基 煙草根際細菌分離、培養、篩選均使用牛肉膏蛋白胨培養基（NA）：蛋白胨10g，氯化鈉5g，牛肉膏3g，瓊脂15g，水1000mL，pH 7.0～7.2[7];青枯病病原菌培養使用TCC培養基：蛋白胨10g，氯化鈉5g，牛肉膏3g，加入1%TTC，瓊脂15g，水1000mL，pH 7.0～7.2。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種初篩 按梯度稀釋土壤樣品。取1g土壤樣品置于裝有9mL無菌水的滅菌試管內，并將其混合均勻得到10-1土壤稀釋溶液;取1mL該土壤稀釋液，轉移至裝有9mL無菌水的新試管內，充分混合得到10-2土壤稀釋溶液[8];以此類推，同樣操作得到10-5、10-6、10-7土壤稀釋溶液。分別吸取100μL 10-5、10-6、10-7土壤稀釋液涂布到NA固體培養基內，將平板置于28℃恒溫培養箱中，培養24h后挑取形態不同的單菌落進行純化培養。

1.2.2 高效生防菌的篩選 取1mL濃度為1×[106]CFU/mL的煙草青枯病菌懸浮液，在TTC培養基滅菌后且溫度冷凝到一定程度后混合均勻倒平板，制成含煙草青枯病菌的培養基。在培養基平板背面距離中心2.5cm處做上標記，每個平板4個角落各做1個標記，然后將滅好菌的牛津杯（孔直徑為6mm）置于背面做好位置標記的培養基上，分別取150μL提前制備好的煙草根際細菌菌懸液置于牛津杯孔內并做好標記，將FZB生防菌菌懸液放入第4個牛津杯中作為對照。置于30℃恒溫培養箱中培養48h后測定抑菌圈大小。每個處理重復3次。通過測量抑菌圈直徑，篩選出對煙草青枯病菌拮抗效果較好的細菌。

1.3 菌種分子鑒定 16S rDNA PCR擴增[9]：PCR擴增引物用27F和1492R，PCR擴增體系：滅菌去離子2l?L，GoTaq?Green Master Mix 25?L，DNA模板2?L，2個引物各1?L，體系共計50?L;PCR擴增條件：95℃預變3min，94℃變性30s，55℃退火1min，72℃延伸100s，35個循環，72℃延伸7min;PCR產物的電泳檢測：取5?L的PCR擴增產物，用移液槍在提前配制好的已經凝固的1%瓊脂糖凝膠上點樣，之后進行電泳，25min左右在紫外燈下對擴增的結果進行檢測，記錄目的片段擴增情況;將擴增的樣品送測序公司測序，結合測序結果在NCBI官網開展BLAST比對，進而對篩選出來的菌株進行初步鑒定。

2 結果與分析

2.1 細菌菌株的分離篩選 經過稀釋涂布法篩選共獲得35株細菌，通過抑菌圈法篩選出2株細菌S3-1、S3-2，對煙草青枯病病原菌均具有拮抗作用，其中S3-1抑菌圈為1.3cm，S3-2抑菌圈為1.4cm，抗青枯病模式菌FZB抑菌圈為1.3cm（圖1）。因此選擇S3-2進行分子生物學鑒定。

2.2 16S rDNA基因序列測定以及分子學鑒定 通過對菌株S3-2進行16S rDNA基因序列測定，對測序結果開展BLAST比對，初步鑒定菌株為芽孢桿菌屬。

3 結論與討論

本次研究采取梯度稀釋分離法和平板涂布純化法對煙草根際土壤進行分離和純化培養，共得到35株疑似生防菌，通過抑菌圈法發現其中2株具有抑菌效果，分別是S3-1菌株和S3-2菌株，S3-2抑菌能力優于抗青枯病模式菌FZB，因此使用S3-2作為后續試驗鑒定的主要菌株。通過對目標菌株開展16S rDNA序列測定，并對測序結果開展BLAST比對，初步鑒定出S3-2菌株屬于芽孢桿菌屬。在后續試驗中，S3-2的發酵液經初步純化后應用于青枯病菌的防控中，表現出較強的抑制效果，因此可作為生物防治手段防治青枯病，同時也有助于改良土壤環境[10]。

參考文獻

[1]易龍，肖崇剛.煙草赤星病防治研究進展[J].植物保護，2003（5）：10-14.

[2]馮吉，黎妍妍，程玲，等.煙草青枯病的生物防治研究進展[J].安徽農業科學，2016，44（1）：203-205，215.

[3]吳曉宗，曾強，李紅麗，等.拮抗菌生物有機肥對植煙土壤和煙草青枯病的影響[J].江蘇農業科學，2017，45（15）：88-91.

[4]吳翔，甘炳成，謝麗源，等.一株煙草青枯拮抗細菌的篩選、鑒定和培養特性研究[J].中國土壤與肥料，2019（2）：208-215.

[5]畢濤.山東省煙草青枯病病原鑒定及化學藥劑和生防菌株的篩選[D].泰安：山東農業大學，2014.

[6]董昆明，陳亮，周曉見，等.1株抑煙草青枯病生防菌的篩選·鑒定及其活性物質研究[J].安徽農業科學，2011，39（31）：19172-19175.

[7]陳欣怡.蘋果輪紋病生防解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）PG12主要生防機制研究[D].北京：中國農業大學，2016.

[8]陳麗，疏秀林，安德榮，等.土壤拮抗放線菌S-5210-6活性產物抑菌譜及其作用機制[J].植物保護學報，2007（3）：277-282.

[9]Svetoslav Dimitrov Todorov，Martina Meincken，Leon Milner Theodore Dicks.Factors affecting the adsorption of bacteriocins ST194BZ and ST23LD to Lactobacillus sakei and Enterococcus sp.[J].The Journal of general and applied microbiology，2006，52（3）：159-167.

[10]何明興，沈亮，邱恒良，等.煙草青枯病的發生及防治[J].現代農業科技，2019（1）：111-112，115.

（責編：徐世紅）