取食聚乙烯微塑料對大蠟螟生長發育的影響

唐瑞 林佳倚 勞喬斌

摘 要：為研究取食聚乙烯（PE）微塑料對大蠟螟生長發育的影響，以期獲得大蠟螟能夠最大程度降解塑料的比例，分別用含PE微塑料5%、10%、15%、20%、25%的飼料飼喂同一齡期的大蠟螟幼蟲，對比其幼蟲期、存活率、幼蟲存活率、蛹期、蛹重、雄雌比、蛹存活率以及CarE酶和GTS酶活性;另設置PE塑料膜直接飼喂大蠟螟試驗，探究大蠟螟幼蟲對塑料膜的取食率以及取食PE塑料膜對幼蟲存活率和蛹重的影響。結果顯示：大蠟螟幼蟲的存活率隨著微塑料比例增加呈不同程度的降低，且幼蟲發育歷期顯著延長，蛹存活率、蛹重顯著降低，而蛹期差異不顯著;GTS酶活性顯著升高，CarE酶活性有所升高但差異不顯著;完全飼喂PE塑料膜，大蠟螟幼蟲平均取食率為18.47%，幼蟲期延長6d且蛹重下降明顯。由此可見，飼料中的微塑料含量對大蠟螟發育歷期、蛹重和解毒酶活性具有顯著影響，大蠟螟能取食塑料且在10%塑料混合飼喂下生長發育受到的影響較小，這為以蟲降解塑料提供了應用基礎。

關鍵詞：大蠟螟;聚乙烯塑料（PE）;資源昆蟲;塑料降解

Abstract： To study the effect of eating polyethylene （PE） microplastics on the growth and development of large Galleria mellonella， and expect to obtain the proportion of Galleria mellonella that can degrade plastic to the greatest extent，the Galleria mellonella larvae were fed with 5%， 10%， 15%， 20% and 25% PE microplastics respectively，and the survival rate， larval survival rate， pupal stage， pupal weight， male female ratio， pupal survival rate， and the activities of care and GTS enzymes were compared. In addition， the experiment of feeding Galleria mellonella with PE plastic film directly was set up to explore the feeding rate of Galleria mellonella larvae on plastic film， survival rate and pupal weight. The results showed that the survival rate of mellonella larvae decreased with the increase of the proportion of micro plastics， and the larval development period increased significantly， the pupal survival rate and pupal weight decreased significantly， but the difference was not significant; the GTS enzyme activity increased significantly， the care enzyme activity increased， but the difference was not significant; the average feeding rate of PE plastic film was 18.47%， the larval stage was prolonged for 6 days， and the pupal weight decreased significantly. The content of microplastics had a significant effect on the development duration， pupa weight and detoxification enzyme activity of Galleria mellonella. Galleria mellonella could feed on plastic and was fed with 10% plastic mixture， which had little effect on its growth and development， which provided a basis for the application of insect degradable plastics.

Key words： Galleria mellonella; Polyethylene plastic （PE）; Resource insects; Degradation of plastics

大蠟螟（Galleria mellonella）屬鱗翅目螟蛾科蠟螟屬昆蟲，其幼蟲取食蜜蜂巢脾、蛀壞蜂具，是養蜂業的重要害蟲。近年來，研究發現大蠟螟不僅自身蛋白質含量豐富，而且具有生長周期短、食料來源豐富、易于繁殖以及可食用和飼用等優點，更重要的是其在醫學、藥學、生理學、農學等學科領域發揮著不可替代的作用[1]。近年來大蠟螟幼蟲降解塑料的功能得到廣泛關注，并且這一功能也得到了證實[2]。目前發現可以啃食塑料的昆蟲還有很多，而關于昆蟲降解塑料的機理，普遍認為與其腸道細菌的作用密不可分，如分別從能夠取食塑料的黃粉蟲和印度谷螟腸道內分離得到能夠降解聚苯乙烯和聚乙烯的細菌菌株[3]，從大蠟螟腸道中分離出2 株細菌在實驗室環境中能夠生長并分解聚乙烯塑料[4]。這些研究說明利用昆蟲降解塑料的理論可行性。

利用昆蟲降解塑料不僅可以解決塑料的污染問題，還能將塑料轉變為昆蟲自身蛋白，達到變廢為寶、資源再利用的目的[5]。相對于其他食塑料昆蟲而言，大蠟螟具有發育歷期短、食量大、易飼養等特點。目前針對大蠟螟降解塑料的研究僅停留在少量實驗對其降解性的研究[2]，國內外對大蠟螟降解塑料的特性研究均較少，且取食塑料對大蠟螟生長發育相關參數是否存在影響還未見報道?；诖耍P者通過比較飼喂不同比例微塑料后大蠟螟幼蟲、蛹等發育參數、解毒酶活性等，以期探索大蠟螟降解塑料的能力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試蟲和試劑 大蠟螟（廣東海洋大學實驗室喂養）。聚乙烯（PE）微塑料（邁森生物科技有限公司），PE塑料保鮮袋，大蠟螟飼料[6]（麩皮60g、面粉60g、玉米粉60g、酵母粉30g、奶粉50g、蜂蜜50g、甘油50mL），羧酸脂酶（CarE）、谷胱甘肽-S-轉移酶（GTS）活性試劑盒（蘇州科銘生物技術有限公司）。

1.1.2 主要儀器 恒溫光照培養箱，千分之一天平，養蟲盒（15cm×10cm×8.5cm，1000mL圓形塑料盒），解剖鏡，低溫離心機（國藥集團中科器深圳有限公司），超低溫冰箱，分光光度計（中科器進出口深圳有限公司）。

1.2 試驗設計 試驗共設6個處理，即聚乙烯（PE）微塑料添加比例分別為0%、5%、10%、15%、20%、25%。每處理各30 頭，所有試蟲均為2齡（約3mm）[7]幼蟲。各處理大蠟螟均在25℃的恒溫培養箱中飼養。每5d更換1次飼料并對飼養大蠟螟的養蟲盒進行1次清掃。每天觀察并統計存活數直至化蛹或羽化，及時清除死亡蟲體，蛹單獨稱重并使用解剖鏡鑒定[8]，記錄其性別。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 幼蟲體內解毒酶活性測定 為探究取食微塑料后大蠟螟體內解毒酶活性的變化情況，進行了羧酸酯酶（CarE）和谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）活性測定。選取各飼喂處理的老熟幼蟲（約8齡）[7]各3頭，單獨稱重后保存于-80℃超低溫冰箱。檢測前取出蟲體并在4℃冰浴中加入酶活性試劑研磨成液體，按照酶活性試劑盒說明進行測定。

1.3.2 大蠟螟對塑料膜的取食率測定 為較直觀地觀察到塑料膜質量變化，以體長1cm（約6齡）[7]的大蠟螟幼蟲為試蟲，全部喂食PE保鮮袋，20頭為1組，共3組，以正常飼料飼喂的大蠟螟初孵幼蟲作為對照。飼喂前及飼喂后每4d稱量各組塑料袋的質量，直至塑料袋質量不再變化，記錄期間幼蟲存活率及蛹重。

1.4 數據處理 利用 Excel 2016 記錄和整理數據，運用SPSS 19進行方差分析。采用Dunce比較法比較取食不同比例微塑料與人工飼料混合物的大蠟螟幼蟲平均發育歷期、幼蟲存活率、蛹期、平均蛹重的差異顯著性，百分率數據方差分析之前進行反正弦平方根轉換。采用EXCEL軟件對取食不同比例微塑料與人工飼料混合物的的羧酸酯酶與谷胱甘肽S-轉移酶的活性進行作圖。

2 結果與分析

2.1 不同比例微塑料對大蠟螟幼蟲生長發育的影響 由表1可知，在不同比例微塑料飼喂下，大蠟螟均能完成正常生長發育，且隨著微塑料含量的增加，大蠟螟發育歷期呈延長趨勢，且不同比例對大蠟螟生長發育影響顯著（P<0.05）;飼喂微塑料后大蠟螟的幼蟲存活率均低于對照，其中微塑料含量為20%時大蠟螟幼蟲存活率最低，但總體而言微塑料對幼蟲存活率影響不顯著（P=0.477）。

2.2 不同比例微塑料對大蠟螟蛹發育的影響 由表2可知，與對照相比，不同比例微塑料飼喂下大蠟螟的蛹期均有不同程度縮短，其中5%組的蛹期最短，但總體而言各處理差異不顯著（P=0.276）;隨著微塑料比例的增加，各處理的平均蛹重均有不同程度下降，其中25%組大蠟螟蛹重最小，且與其他處理間差異顯著（P<0.05）;對照組和10%組的雄雌比都接近1∶1，而其他組的差異較大，均為雄性蛹較多;10%組大蠟螟的蛹存活率與對照組相近，25%組的蛹存活率最低（55.5%），其余組蛹存活率均明顯低于對照組。

2.3 不同比例微塑料對大蠟螟幼蟲體內解毒酶活性的影響 由圖1、2可知，取食添加了微塑料的飼料后，大蠟螟幼蟲體內谷胱甘肽S-轉移酶（GTS）活性顯著提高（P<0.05），其中10%組時GTS酶活性最高，顯著高于15%、5%和對照組，但羧酸酯酶（CarE）活性增加不顯著（P=0.205）。由此可見，大蠟螟體內GTS酶活性受到微塑料影響顯著，而CarE酶活性受微塑料影響不顯著。

2.4 大蠟螟對塑料膜的取食作用 由圖3可知，大蠟螟取食PE塑料膜，在飼喂16d直至塑料膜質量不再減少的過程中，塑料膜平均總質量減少0.198g，最高總取食率達到25.51%，平均總取食率也達到18.47%，說明大蠟螟對PE塑料膜的取食率良好;同時，大蠟螟的存活率隨著取食塑料膜天數的增加而降低，并在第20天全部化蛹，幼蟲期延長了6d，說明以PE塑料膜作為唯一食料減緩了大蠟螟的發育進度。

大蠟螟幼蟲取食PE塑料膜后留下大小不等的空洞（圖4），并且在蛹期蛹的大小差異明顯（圖5），同一齡期開始飼喂的大蠟螟幼蟲，正常飼料飼喂下平均蛹重為0.24± 0.058g，而取食塑料膜后則為0.15±0.046g，下降較明顯。通過點燃大蠟螟的糞便，發現其燃燒時并未產生刺激性氣味，因此初步認為大蠟螟幼蟲完全降解所食的PE塑料，但降解后的產物成分還需進一步研究。<＼＼Zaondvkp3mo4vvb＼共享＼2020年農學通報＼農學通報2020-23期＼5693-4.tif>

3 結論與討論

試驗結果表明：在取食5%～25%微塑料條件下，大蠟螟均能完成正常生長發育，且隨著飼喂塑料比例的增大，大蠟螟幼蟲發育歷期呈延長趨勢但差異較小，幼蟲存活率也呈較明顯的降低趨勢。究其原因可能在于：（1）營養不足。PE塑料作為非常規食物能在一定程度上維持大蠟螟生長，但并不能為大蠟螟提供充足且全面的營養成分;（2）細菌感染。大蠟螟由于沒有獲得充足的營養導致體質較弱，容易受到細菌感染變黑死亡;（3）自相殘殺。由于沒有足夠的營養，大蠟螟會出現自相殘殺的現象。這與許詩杰等[3]在研究黃粉蟲取食塑料后的生命特征時得出的原因相近。

在幼蟲存活率、蛹期、蛹重、雄雌比、蛹存活率以及酶活性方面，可以明顯觀察到隨著取食PE塑料比例的增加，大蠟螟受到的影響呈增加趨勢，但從試驗結果看，10%組受到的影響相對小于其他組，與對照組相近。據報道，除了大蠟螟，能夠取食塑料的昆蟲還有黃粉蟲、大麥蟲、赤擬谷盜等，黃粉蟲的最適飼料比為泡沫∶麩皮=1∶6，即當飼料中添加14.28%泡沫時黃粉蟲的生長狀況以及對泡沫的降解作用最優 [9]，這與本試驗大蠟螟最適塑料比例相近，但由于本試驗所配置的飼料不同，可能導致數據結果稍有差異。這說明10%的塑料比例與飼料混合飼喂時，大蠟螟能夠最大程度降解塑料，同時又可保證自身正常生長發育繁殖，而其體內受到的其他生理影響以及具體塑料降解率還需后續試驗進一步探明。

相較于正常飼喂的大蠟螟幼蟲，取食塑料薄膜的大蠟螟幼蟲發育歷期延長、蛹重下降，造成其發育不良的原因可能與單一取食PE塑料而無其他營養來源有關，為此后續試驗應研究能夠滿足大蠟螟正常生長發育的混合飼料。本試驗研究了大蠟螟對PE塑料膜的取食速率但未探究大蠟螟對PE塑料的降解率，即取食塑料的量和體內殘留的量，為此還需設計新型飼料和改進飼喂模式來探究大蠟螟對PE塑料的降解率。

參考文獻

[1]劉奇志，田里，蒲恒滸.大蠟螟作為試驗昆蟲資源的利用現狀[J].昆蟲知識，2009，46（3）：485-489.

[2]Paolo Bombelli，Christopher J. Howe，Federica Bertocchini. Polyethylene bio-degradation by caterpillars of the wax moth Galleria mellonella[J]. Current Biology，2017，27（8）：292-293.

[3]許詩杰，張雅林.取食塑料的黃粉蟲生命特征研究[J].西北農林科技大學學報（自然科學版），2018，46（7）：102-108.

[4]何歡，楊明飛，楊美華，等.塑料飼養大蠟螟幼蟲腸道可培養細菌多樣性[J].微生物學通報，2019，46（3）：577-586.

[5]張可，胡芮綺，蔡珉敏，等.黃粉蟲取食和消化降解PE塑料薄膜的研究[J].化學與生物工程，2017，34（4）：47-49.

[6]劉位芬，梁鋮，宋文菲，等.一種易于實驗室批量繁殖大蠟螟的方法[J].中國蜂業，2016，67（6）：34-35.

[7]周永富，羅岳雄，陳華生，等.大蠟螟個體生物學研究[J].昆蟲天敵，1988（4）：182-186.

[8]楊爽，劉位芬，梁鋮，等.蜂群中大蠟螟蛹及成蟲雌雄的鑒別方法[J].蜜蜂雜志，2017，37（3）：8-10.

[9]徐世才，唐婷，閆宏，等.黃粉蟲在不同飼料比例下的泡沫降解率研究[J].環境昆蟲學報，2013，35（1）：90-94.

（責編：徐世紅）