復方中藥燈銀腦通提取工藝的正交試驗研究

孫潤 段月娟 龔云麒 劉軍鋒 楊兆祥

摘要：目的 優選復方中藥制劑燈銀腦通膠囊的提取工藝。方法 對水提取過程中的加水量、提取次數、提取時間因素進行單因素實驗、正交試驗考察，以出膏率和野黃芩苷含量為衡量指標優選出最佳提取工藝，并放大處方驗證優選工藝的穩定性。結果 優選出的最佳提取工藝為：加水量10倍，提取3次，每次2h。結論 綜合考慮生產需求優選的工藝，驗證試驗證明工藝可靠穩定，重復性 較好，適合于大生產。

關鍵詞：燈銀腦通;出膏率;含量;正交試驗;提取工藝

中圖分類號：R927.11?? 文獻標志碼：A?? 文章編號：1007-2349（2020）12-0068-04

燈銀腦通膠囊，為傳統彝族藥“腦癱愈”改良而來，本品由燈盞細辛、三七、銀杏葉、滿山香四味藥材組成，具有行氣活血，散瘀通絡的功效，用于中風中經絡，瘀血阻絡證。目前對燈銀腦通膠囊研究主要是藥理學方面研究，如燈銀腦通膠囊聯合其他相關藥物對治療腦梗死、血管性癡呆（VD）、后循環缺血性眩暈、改善腦微循環和認知障礙均具有較好的臨床療效，有較高的安全性和一定的臨床應用價值[1-4]。藥物質量方面的研究較少，主要涉及藥物中指標化合物的含量測定，且趨勢為利用一種色譜條件同時測定多種指標化合物的含量[5-6]。尚未見對燈銀腦通膠囊提取工藝研究的報道，且現存工藝較為簡單，故對燈銀腦通膠囊的提取工藝研究對其深入發展具有重要意義。經研究表明，燈盞花素可抑制脂質過氧化反應，抗超氧化自由基，減少腦組織缺血及再灌注損傷，改善血管性認知功能障礙臨床癥狀[7-8]。燈盞花乙素（野黃芩苷）即是在燈盞細辛藥材中提取所得，故本文采用野黃芩苷含量作為提取工藝研究中的一個衡量指標。本實驗選用燈盞花、三七、銀杏葉、滿山香為主要原料，采用傳統的水提法進行提取，通過單因素實驗法與正交實驗相結合的方式，以出膏率和野黃芩苷含量為指標，優選提取工藝，得到最適宜的提取工藝。

1 材料與儀器

1.1 儀器設備 1100 Agilent高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）、電子分析天平（梅特勒-托利多公司，XSE205DU）、旋轉蒸發器（瑞士Buchi，R-3）、超聲波清洗儀（鞏義市予華儀器有限公司）、循環水真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）、真空干燥箱（鞏義市予華儀器有限責任公司）

1.2 原料及對照品 燈盞花、三七、銀杏葉、滿山香藥材均購于亳州千草藥業有限公司，經鑒定分別為菊科植物短葶飛蓬Erigeron breviscapus（Vant.）Hand.-Mazz.的干燥全草;五加科植物三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen的干燥根和根莖;銀杏科植物銀杏Ginkgo biloba L.的干燥葉;滿山香Schisandra propinqua（Wall.）Baill.為木蘭科五味子屬植物合蕊五味子的干燥根和莖;野黃芩苷標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110842-201709）。

2 實驗方法

2.1.1 對照品溶液配制 取野黃芩苷對照品，精密稱定，加甲醇制成1 mL含40ug的溶液，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液的配制 取本品裝量差異項下的內容物，研細，取0.065 g（折合提取物0.02675 g），精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理（功率160KW，頻率50kHZ）10 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 色譜條件 以十八烷基鍵合硅膠為填充劑：以0.3%磷酸水為流動相A，以乙腈為流動相B，按以下梯度洗脫，流速為0.8 mL/min，柱溫45℃，檢測波長為335nm，進樣體積10ul。理論塔板數按野黃芩苷峰計算應不低于10000。

2.2 提取物的提取工藝單因素實驗法考查

2.2.1 加水體積對出膏率和野黃芩苷含量的影響 稱取燈盞花、銀杏葉、滿山香藥材粗粉各50 g，三七藥材粗粉20 g，稱取5份，5份藥材在提取過程中的加水體積分別為 4、6、8、10、12BV，加熱回流提取3次，每次 2 h，合并3次提取液，減壓過濾棄渣，濃縮至一定相對密度（1.10～1.20/60℃），加乙醇調至含醇量70%，靜置24h，過濾，濾液蒸發濃縮，真空干燥，備用。

2.2.2 提取時間對出膏率和野黃芩苷含量的影響 稱取燈盞花、銀杏葉、滿山香藥材粗粉各50 g，三七藥材粗粉20 g，稱取5份，加入10BV水，加熱回流提取3次，5份藥材在提取過程中分別提取 1、2、3、4、5h，合并3次提取液，減壓過濾棄渣，濃縮至一定相對密度（1.10～1.20/60℃），加乙醇調至含醇量70%，靜置24h，過濾，濾液蒸發濃縮，真空干燥，備用。

2.2.3 提取次數對出膏率和野黃芩苷含量的影響 稱取燈盞花、銀杏葉、滿山香藥材粗粉各50 g，三七藥材粗粉20 g，稱取5份，加入10BV水，5份藥材在提取過程中分別加熱回流提取1、2、3、4、5次，提取 2 h，合并3次提取液，減壓過濾棄渣，濃縮至一定相對密度（1.10～1.20/60℃），加乙醇調至含醇量70%，靜置24h，過濾，濾液蒸發濃縮，真空干燥，備用。

2.3 提取物的提取工藝正交試驗 以出膏率和野黃芩苷含量為指標，采用水回流提取法，分別對加水體積（A）、提取時間（B）、以及提取次數（C）這3個因素進行分別考查，根據單因素實驗結果，每因素選取3個水平，按 L9（33）進行正交試驗，因素影響水平見表 1。

3 結果

3.1 加水體積對出膏率和野黃芩苷含量的影響 測定不同加水體積對出膏率和野黃芩苷含量的影響，結果見圖1。

從圖1可知，隨著加水體積的增加出膏率和野黃芩苷含量越來越高，當加水體積為10BV是時，出膏率和野黃芩苷含量都基本達到最高值，隨后斜率增長緩慢，從經濟性方面考慮，加水體積為10BV是最合理的選擇，既能達到最好出膏率和野黃芩苷含量也能降低生產的經濟成本。

3.2 提取時間對出膏率和野黃芩苷含量的影響 測定提取時間對出膏率和野黃芩苷含量的影響，結果見圖2。

從圖2可知，隨著提取時間的增加野黃芩苷含量增加，當提取時間為 2h時，出野黃芩苷含量達到較高值;而出膏率僅是稍微上升、波動，說明提取時間對其影響較小，綜合考慮生產需求與操作，因此提取時間應選擇2h。

3.3 提取次數對出膏率和野黃芩苷含量的影響 測定不同提取次數對出膏率和野黃芩苷含量的影響，結果見圖3。

從圖3可以看出，隨著提取次數的增加，出膏率逐漸增加，而野黃芩苷含量在提取次數為3次時基本達到最大值;綜合考慮生產需求，提取次數為3次是提取的最佳工藝。

3.4 正交試驗結果與分析 以出膏率和野黃芩苷含量為指標，通過極差 R 和均值 K 的比較，優化燈銀腦通提取物的最佳提取工藝，結果見表 2。

從表 2 的正交試驗結果可知，以出膏率為指標，極差最大的是11.23，可以看出提取工藝主要的影響因素是提取次數（C），各因素影響順序為 C>A>B，對均值分析可知，最佳提取工藝為A3B3C3。即加水體積12BV，提取時間為3h，提取次數為3次時，出膏率最高。以野黃芩苷含量為指標，極差最大的是0.87，?可以看出提取工藝主要的影響因素是提取次數（C），各因素影響順序為 C>B>A，對均值分析可知，最佳提取工藝為A2B2C3。即加水體積10BV，提取時間為2h，提取次數為3次時，野黃芩苷含量最高，野黃芩苷含量測定HPLC圖譜見圖4、圖5。

4 驗證試驗

稱取燈盞花、銀杏葉、滿山香藥材粗粉各5000 g，三七藥材粗粉2000 g，稱取3份，加入10BV水，加熱回流提取3次，提取2 h，合并3次提取液，減壓過濾棄渣，濃縮至一定相對密度（1.10～1.20/60℃），加乙醇調至含醇量70%，靜置24h，過濾，濾液蒸發濃縮，真空干燥，備用。結果見表3。

通過平行 3 次驗證試驗，出膏率、野黃芩苷含量的結果，其 RSD 值均小于2%，表明工藝穩定、合理。

5 討論

本實驗以燈盞花、三七、銀杏葉、滿山香為主要原料，研究了水提法提取燈銀腦通提取物的提取工藝。分析出膏率的極差 R 和均值 K，提取次數、加水量對出膏率的影響較顯著，提取時間對出膏率影響不顯著。對野黃芩苷含量的極差 R 和均值 K分析后發現，提取次數，提取時間、加水量對野黃芩苷含量影響均較為顯著，綜合考慮生產需要、實際提取過程中的成本和能耗，因此在實際的生產過程中，采用加水量 10 倍，提取3次，每次 2h。驗證試驗結果可見小試最佳的工藝一定程度適合于生產工藝，為中試提供了相應的數據支持，該提取工藝為后續的生產及中藥材的開發利用提供了一定的借鑒意義。

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（收稿日期：2020-07-06）

基金項目：云南省科技廳重大科技專項（2015ZJ007）

作者簡介：孫潤（1996-），男，在讀碩士，研究方向：天然產物方向。

通信作者：楊兆祥，E-mail：yangzxky@163.com