安徽省草莓空心病病原菌的分離與鑒定

寧志怨 伊興凱 魏發勝 錢小強 孔晶晶 黃錫桂 張殿興 田峰

摘要 對來源于安徽、遼寧和河北地區的草莓空心病株的病原菌進行了分離、純化、形態觀察以及分子生物學鑒定。結果顯示，該病原菌在PDA平板上均呈放射狀，菌絲的顏色一般為白色，菌絲上具有分枝且分生孢子呈橢圓形和鐮刀形。使用PCR法擴增該病原菌的ITS和18S rDNA的序列并進行DNA克隆和測序。根據測序結果，對病原菌的ITS和18S rDNA序列的BLAST同源性對比和系統進化樹分析。最終根據病原菌的外部特征和分子鑒定的結果證明引起草莓空心病的病原菌為Fusarium solani。該研究為草莓空心病的防控提供科學依據。

關鍵詞 草莓空心病;rDNA-ITS序列;茄屬鐮孢;進化樹分析

中圖分類號 S436.68+4文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）24-0136-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.24.037

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Isolation and Identification of the Pathogen of Strawberry Plant Hollow Disease in Anhui Province

NINGZhiyuan1，YI Xingkai1，WEI Fasheng2 et al （1.Horticultural Research Institute，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei，Anhui 230031; 2.Changfeng County Agricultural Technology Extension Center，Changfeng，Anhui 231100）

Abstract The pathogens of strawberry plants with hollow disease originating from Anhui，Liaoning and Hebei Province were isolated，purified，morphologically observed and molecularly identified.The results showed that the pathogen was radial on the PDA media，the color of the hypha was generally white，the hypha had branches and the conidia were oval and sickleshaped.The PCR method was used to amplify the sequence of ITS and 18S rDNA of the pathogen genome and the amplified fragments were performed by DNA cloning and sequencing.According to the result of DNA sequencing，homology comparison and phylogenetic tree analysis of ITS and 18S rDNA sequences were conducted.Finally，according to the external characteristics of the pathogen and the results of molecular identification，it was proved that the pathogen causing strawberry hollow disease was Fusarium solani.This study provides a scientific basis for the prevention and control of strawberry hollow disease.

Key words Strawberry hollow plant disease;rDNAITS sequence;Fusarium solani;Phylogenetic tree analysis

草莓（Fragaria ananassa Duch.）屬薔薇科草莓屬植物，因其色澤艷麗且富含多種營養成分，是冬季時令且經濟價值較高的水果之一，市場需求量較大。近年來，隨著我國水果產業的發展，草莓栽培已成為廣大農戶脫貧致富的重要途徑之一。但隨著種植面積擴大、重茬年限增加以及長期的無性繁殖，一些草莓新病害逐漸發生并在國內逐漸蔓延開來，如草莓空心病近年來在國內多地包括北京、遼寧、河北、江蘇、浙江等全國大部分草莓種植區均有報道，并隨著種苗的運輸等因素逐漸在國內蔓延開來，造成大量死苗，給農戶造成嚴重的損失，已嚴重影響我國草莓產業的健康發展。筆者所在課題組于2019年底起對省內幾個主要的草莓種植基地進行實地調查，結果顯示空心病在省內部分地區已經發生并開始傳播蔓延。目前造成草莓空心病暴發的重要原因是病原菌不清楚和無有效的防控技術措施，針對上述情況，筆者在對安徽省草莓空心病病原菌分離和純化的基礎上，結合病原菌的形態特征、分子鑒定和致病性檢測結果，確定安徽省草莓空心病的致病菌，從而為草莓空心病的科學防控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 空心病病樣采集和病原菌的分離和形態特征鑒定

草莓空心病一般在定植現蕾后或育苗期匍匐莖抽生時表現出癥狀，尤其是現蕾后發病導致農戶錯過補苗的最佳時間，給農戶帶來的損失相對較大;在病害發生的中后期，病原菌在短縮莖內大量增殖會導致草莓的短縮莖內出現孔洞且易掰斷，故稱草莓“空心病”（圖1A～D）;另一方面植株的葉片沒有光澤，心葉略有發黃，部分植株甚至呈現類似“黃萎病”的心葉扭曲現象（圖1C）;病原菌侵染后隨著維管束組織向上侵染至心葉的莖尖組織（圖1E～F），三出復葉的葉脈泛紅同時老葉葉片邊緣干枯等。該病害具有較強的傳染性，一旦母株感病可能會導致連接的子苗受感染，給生產上帶來潛在的危險。

2019年11月底在安徽省阜陽、宿州等地進行草莓空心病的發病情況調查，同時從河北、遼寧省等地寄送的草莓空心病病樣中，共采集草莓病株12份。在病株短縮莖頂端的病健交界處切取6～8 mm2的組織塊進行致病菌的分離、純化和形態特征鑒定等，具體做法參照寧志怨等[1]的方法。

1.2 病原菌的致病性鑒定 為了驗證科赫法則，將分離到的病原菌對草莓匍匐莖苗進行回接種以確定分離出的培養物是否能在草莓上引起上述病害。通過使用制備的病原菌孢子懸浮液對健康的草莓匍匐莖種苗進行回接種鑒定。首先，將草莓植株上分成2個獨立的試驗組：空白對照組和病原菌侵染組，每個試驗組包含10株草莓苗，每個試驗組重復3次。在病原菌侵染試驗組中，在草莓根部浸入每種分離物的孢子懸浮液（2×107～3×107/mL）10～15 min，重復3次;作為對照，使用無菌水模擬接種草莓根部10～15 min，重復3次。將2組接種的草莓植株分別置于25 ℃的溫室中且相對濕度60%～80%條件下保濕16～18 h，然后將其置于相對濕度70%～80%、溫度20～26 ℃溫室大棚中，按照當地常規的方法進行管理，直至草莓植株出現癥狀。

1.3 分子鑒定

將真菌分離物置于培養基中于25 ℃下培養6～7 d后用于病原菌基因組DNA的提取、種屬特異性引物的擴增、擴增片段的回收和測序分析，具體做法參照寧志怨等[1]的方法。最后，使用DNAMAN等相關生物軟件對測出的序列文件進行構建和編輯。

為了研究分離病原菌的進化關系，使用BLAST搜索與已知病原菌種屬特異性序列（ITS和18S rDNA）進行同源性比較。然后，使用MEGA6.0中的Maximum Parsimony Trees進行系統進化樹分析[2]。為了比較所獲得的真菌序列，來自不同物種病原菌Fusarium solani的ITS和18S rDNA序列被用于該研究。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離和病原體的特征

在來自河北、遼寧省和皖北地區的阜陽、宿州市等地的草莓空心病病樣中，隨機選取的12株具有典型空心病發病特征的草莓病株用于病原菌的分離和鑒定。結果顯示，2個平板被霉菌污染，3個平板未分離出任何病原體。最后一共從感病的植株中共分離出5種病原菌，其中遼寧和河北省各1份，其余均來源于省內。然后使用單孢子法對分離出的病原菌進行分離和純化。結果顯示，在PDA培養基上產生的上述病原菌的菌落均呈白色放射狀，表面粗糙（圖2A），背面為淺黃色。在形態學物種鑒定中，將這些分離物在PDA培養基平板上培養，并置于培養箱中培養。將收獲的分生孢子用顯微鏡進行觀察。結果顯示分離出的病原菌產孢的數量均較多，分生孢子一般具有隔膜，小型分生孢子呈腎形，大型分生孢子呈鐮刀型（圖2B～C）。表明這些病原菌的分離物在形態特征上與Fusarium solani相似。

2.2 致病性

利用浸根接種法，將上述病原菌產生的分生孢子對健康的草莓匍匐莖苗進行回接種試驗，3次重復，以水作為空白對照。在接種30 d后，試驗組的草莓植株逐漸表現出一些和田間空心病相類似的發病癥狀。心葉生長停滯，少量心葉的葉柄上出現明顯的發紅癥狀，部分心葉葉邊發黃并表現出類似“草莓黃萎病”的心葉扭曲現象（圖3A～B）;在較老的三出復葉的葉片上，葉片和葉柄的結合部出現發紅并干枯，有1～2片葉片干枯并最終死亡（圖3C～D）。隨著時間的延長，除心葉外大部分老葉逐漸死亡，心葉仍保持生長停滯，但對抽生的匍匐莖苗影響不大，縱切感病植株的根莖結合部發現有橘紅色的變色出現，未抽出的心葉呈焦枯狀，這可能是導致感病草莓生長停滯的原因（圖3E～F）。但使用無菌水模擬接種作對照草莓植株未表現出任何發病癥狀。上述癥狀和之前在田間采集的空心病病株的癥狀基本相似（圖3A、B）。從上述接種后發病的植株上按照上述方法重新進行病原菌的分離、培養、形態特征檢查和種屬分析后被重新鑒定為Fusarium solani。重新分離出的致病菌在形態特征上也與來源于田間的病原菌基本一致。

2.3 分子鑒定

按照上述方法從PDA培養基上收集的菌絲體用于病原菌基因組DNA的提取，通過瓊脂糖凝膠電泳分析后，所提取的基因組DNA均基本上符合聚合酶鏈式反應的需要。利用PCR技術對每個病原菌的DNA進行擴增ITS和18S rDNA引物后，上述擴增產物中經電泳分離出約530 bp和1 300 bp的PCR產物（圖4）。在對上述特異性DNA條帶進行回收、純化和測序后，結果顯示上述序列是基本相同并分成2個獨立的組（IS00596-1-NS和IS00596）。然后將這些序列與已經登錄在NCBI數據庫中的序列進行同源性比對。根據比對結果，分離克隆出的18S rDNA序列與GenBank登錄號EU710826.1、KM096318.1分別具有99.85%、99.77% 同源性，ITS序列與GenBank登錄號MN504655.1、MN227535.1序列具有100%同源性，這2組序列分別來源于Fusarium sp.和Fusarium solani。

在進化樹分析中，從GenBank獲得的總共18個來源于Fusarium sp.和Fusarium solani的18S rDNA序列和ITS序列（其中包括IS00596和IS005961-NS序列）用于構建進化樹。使用MEGA6.0軟件中的Parsimony Trees程序進行進化樹的分析。18S rDNA系統發育進化樹分析結果表明分離出的病原菌的18S rDNA與Fusarium sp.的高度同源。ITS序列進化樹的分析結果顯示，該病原菌ITS序列和Fusarium solani同源性非常高（圖5）。綜上所述，根據分離出病原菌的外部形態特征和分子生物學鑒定結果都證明引起草莓空心病的病原菌為Fusarium solani。

3 討論

在回接種試驗中孢子懸浮液制備過程中發現分離出的病原菌Fusarium solani在培養過程中病原菌的產孢能力較強，能夠在短時間內產生大量孢子（圖2B）。在利用制備的孢子懸浮液對供試匍匐莖苗的根部進行浸根接種后，供試植株表現為生長停滯，長時間沒有新生的葉片抽出（圖3D），同時較老的葉片上三出復葉上葉片和葉柄的結合部最初表現出發紅后逐漸干枯，有1～2片葉片首先表現癥狀并最終干枯死亡（圖3C）。隨著時間的延長，除心葉外大部分老葉逐漸死亡，剖開病株根莖結合部的維管束組織有橘紅的變色，老葉和植株相連的維管束組織變色明顯，未展開的心葉已經變成灰色并表現出已被侵染的跡象（圖3F），說明病原菌Fusarium solani已經侵染到老葉、根莖結合部的維管束組織和心葉中，上述癥狀與Pastrana等[3]報道病原菌Fusarium solani侵染草莓的癥狀以及田間發病癥狀基本一致。但該研究中該病原菌未能引起維管束組織中形成空洞，這可能是由于匍匐莖苗本身長勢相對較弱，接種濃度較高導致植株發病較快。此外，研究中還發現該病原菌能夠使母株表現出較為嚴重的癥狀，但其抽生匍匐莖子苗均未表現出明顯的癥狀，但與健康的匍匐莖苗相比長勢相對較弱。上述情況說明感染該病原菌的匍匐莖子苗在后期草莓栽培中可能具有潛在的風險。最后，在回接種試驗中發現感染該病原菌的草莓同時還會引起其他病菌感染導致的并發癥，如在較老的葉片上表現癥狀時還會有細菌和霉菌等協同感染。

綜上所述，該研究通過分離出的病原菌的形態特征和分子生物學鑒定結果，認為Fusarium solani侵染草莓并通過根系向上傳導并會引起中柱變色，可能是導致草莓空心病的原因。據報道，Fusarium solani在自然界中具有廣泛的寄主范圍，且已經報道了病原菌侵染馬鈴薯[4]、黃瓜[5]、核桃[6-8]、大豆[9-10]、嶺南楝樹[11]、北美紅橡[12]和甜葉灌木[13]等。上述分析表明病原菌可能來源于上述植物并通過交叉感染侵染草莓，因此在未來的工作中有必要通過不同作物之間的重接種試驗來確定該病原菌的可能來源。同時，上述研究也為更好地理解Fusarium solani感染植物的分子機制提供了依據。

參考文獻

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