MPB64免疫膠體金檢測法快速分枝桿菌鑒定的應用

玉海玲 閉德武 覃慧芳 磨立達 羅曉璐

WHO 2017年全球結核病報告顯示，我國結核病年發病率64/100000，每年新發病例895000例，結核病總人數繼印度之后為全球第2位。快速診斷結核分枝桿菌復合群（Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC）感染，使結核病早發現、早治療，可以有效減少結核病的傳播，對結核病的防治起到重要的作用。近年來，隨著HIV感染人數的增多、免疫抑制劑的應用、慢性病的長期用藥等原因，導致機會性非結核分枝桿菌（Nontuberculous mycobacteria，NTM）的感染人數增多。NTM感染與MTBC感染的癥狀、肺部X線影像以及全身中毒癥狀、局部表現、臨床表現非常相似，使得臨床難以區分。且NTM對抗結核藥物大多呈天然耐藥，故抗結核藥治療效果不佳，反而對患者機體造成不必要的損傷。因此，在分枝桿菌培養陽性后，盡快做分枝桿菌鑒定，以明確結核分枝桿菌復合群和/或非結核分枝桿菌的感染尤為重要。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集2018年7月至11月在本院門診就診和住院的294例結核病患者的分枝桿菌分離株。將菌株制備成10-2和10-4麥氏濃度的懸濁菌液，接種于硝基苯甲酸（PNB）鑒別培養基上，置37℃生化恒溫培養箱培養28d，觀察菌株在PNB培養基上的生長情況；同時利用免疫膠體金試劑盒（凱必利）分別檢測分離株的MPB64特異蛋白抗原，將兩種方法的鑒定結果進行比較。分離株的最終鑒定結果以基因芯片法的分枝桿菌菌種鑒定結果作為比對標準。

1.2 儀器與試劑 37℃恒溫生化培養溫箱（上海森信試驗儀器有限公司）；PNB培養基（珠海貝索生物技術有限公司）；MPB64結核分枝桿菌抗原檢測試劑盒凱必利（杭州創新生物檢控技術有限公司）；GeneAtlasTM芯片系統及配套試劑（博奧生物集團有限公司）

1.3 試驗原理方法 （1）PNB的檢測原理：98%～100%的結核分枝桿菌復合群在含500μg/ml PNB的羅氏培養基上不能生長，而非結核分枝桿菌中除個別種的少量菌株外，均能耐受500μg/ml的PNB，在固體培養基上生長良好［1］。（2）菌液的制備：在內有玻璃珠的無菌小瓶中加入0.2ml生理鹽水，挑取羅氏培養基上適量菌落置于生理鹽水小瓶內，擰緊蓋子，于漩渦振蕩器研磨，將研磨過的菌株制成1麥氏單位懸濁菌液備用。制備10-2麥氏濃度懸濁菌液。（3）PNB 培養基法：在生物安全柜內，取制備好的10-2懸濁菌液100μl均勻接種于PNB培養基上，置37℃恒溫生化培養溫箱培養28d，觀察PNB培養基中有無分枝桿菌生長，PNB上有分枝桿菌生長即為非結核分枝桿菌，PNB上無分枝桿菌生長即為結核分枝桿菌復合群。（4）MPB64檢測原理：檢測板條的加樣區內含固化的膠體金標記的結核分枝桿菌復合群培養物濾液蛋白64（MPB64）的單克隆抗體A，被檢測線（T）中有固化的結核分枝桿菌復合群培養物濾液蛋白64（MPB64）的單克隆抗體B，質控線（C）處有固化的鼠IgG多克隆抗體C。當樣品在加樣區滴下后，若樣品中含有相應的MPB64抗原（D），樣品中的特異蛋白抗原MPB64和抗體A形成A-D免疫復合物，免疫復合物A-D因毛細層析現象移動至檢測線（T）處，被檢測線（T）中固化的結核分枝桿菌復合群培養物濾液蛋白64（MPB64）單克隆抗體B捕獲，形成A-D-B復合物，并在檢測線（T）處因膠體金的作用形成紫紅色的條帶，這種紫紅色的條帶可以肉眼查看并確定，從而判斷樣品中是否存在待檢的特異蛋白抗原MPB64。若樣品中不含結核分枝桿菌復合群特異蛋白抗原MPB64（D）時，樣品在加樣區滴下后不能形成MPB64抗原-抗體A-D復合物，并于檢測線（T）處將無法形成紫紅色條帶。無論樣本中是否有抗原MPB64存在，膠體金標記抗體A因毛細現象繼續向前移動，在質控線（C）處被固化的抗體C捕獲，形成A-C復合物，并在此形成紫紅色條帶，這顯示了膠體金標記的抗體A在檢測板內的正常移動。結果判讀：檢測線（T）和質控線（C）均出現紫紅色條帶判斷為陽性；檢測線（T）未出現紫紅色條帶，只有質控線（C）出現紫紅色條帶判斷為陰性；若質控線（T）未出現條帶需重新檢測。（5）MPB64結核分枝桿菌抗原檢測：在生物安全柜內，將制備好的1麥氏懸濁菌液吸取100μl加入MPB64結核分枝桿菌檢測板條的檢測區，15min觀察檢測板條的顯色情況讀取結果。結果判讀：檢測線（T）和質控線（C）均出現紫紅色條帶為陽性；檢測線（T）未出現紫紅色條帶，質控線（C）出現紫紅色條帶為陰性；質控線（C）未出現條帶需重新檢測。（6）鑒定：294例分離菌株送廣西疾病預防控制中心結核病防治所，以晶芯基因芯片法做分枝桿菌鑒定。

2 結果

PNB鑒定培養基結果：無細菌生長271例為陰性，鑒定為MTBC；有細菌生長23例為陽性，鑒定為NTM。MPB64抗原膠體金法結果：陽性269例，鑒定為MTBC；陰性25例，鑒定為NTM。晶芯基因芯片法結果：MTBC 270例，NTM 24例。PNB鑒定培養基生長試驗和MPB64抗原膠體金檢測兩種方法的符合率為99.32%（292/294）。PNB生長試驗對分枝桿菌復合群的檢出率、靈敏度、特異度分別為92.18%（271/294）、99.63%（270/271）、95.83%（23/24）；MPB64膠 體 金抗原檢測法對分枝桿菌復合群的檢出率、靈敏度、特異度分別為 91.50%（269/294）、99.63%（269/270）、100%（24/24），兩種鑒定方法的結果經配對四格表資料的χ2檢驗，統計學處理后χ2=0.091，P=0.763，兩種鑒定方法的檢測結果比較無顯著性差異。

3 討論

一直以來，對PNB選擇性培養基培養法以其簡單、廉價、相對可靠而得以在全球廣泛應用。目前，我國大部分的醫療機構還是以傳統的PNB培養基培養法對MTBC和NTM進行初步鑒定。該方法是將一定濃度的分枝桿菌菌液接種于500μg/ml對PNB培養基上，置37℃恒溫生化培養箱培養28d，然后觀察菌株在PNB上的生長情況，依據生長情況將分枝桿菌初步鑒定為MTBC和NTM。這種傳統的PNB分枝桿菌菌種鑒定，雖然結果相對可靠，但由于用時太長，難以滿足臨床對快速診治并控制結核病傳播的需要。因此，臨床迫切需要快速、便捷的MTBC和NTM鑒別方法。MPB64是結核分枝桿菌復合群在培養生長繁殖過程中分泌到細胞外的一種特異性蛋白質，可以用來鑒別結核分枝桿菌復合群和非結核分枝桿菌。凱必利試劑盒利用膠體金免疫技術檢測MPB64，其操作簡便，耗時短，只需15min便能獲得準確結果。

MPB64是結核分枝桿菌復合群在培養生長繁殖過程中分泌至細胞外的特異性蛋白質，約占培養濾液中分蛋白總量的8%，相對分子量為2.4×104。MPB64蛋白抗原為結核菌復合群包括人結核分枝桿菌、牛結核分枝桿菌以及牛結核分枝桿菌BCG亞種和非洲結核分枝桿菌特異性的分泌蛋白質。其是在牛結核菌弱毒株BCG中的培養液中首次分離得到，而在非結核分枝桿菌中不形成 MPB64［2-3］。自1984年以來，MPB64即被認定為是MTBC特異性分泌蛋白，故MPB64可以用來區分MTBC和NTM。迄今為止，PNB生長試驗仍是國內大部分結核病實驗室用于鑒別MTBC和NTM的常規方法，雖然結果相對可靠，但其明顯的缺點是耗時太長，出結果需要28d。MPB64 抗原膠體金法是利用膠體金的檢測技術檢測結核分枝桿菌分泌的特異性分泌蛋白 MPB64，只需要15min就能獲得結果。這樣在培養結果報告的當天即可同時作出分枝桿菌鑒定結果，較傳統PNB培養法提前了28d。本資料將MPB64膠體金法與傳統的 PNB 生長實驗做比較，以基因芯片法分枝桿菌菌種鑒定結果作為比對標準。對294例樣本檢測顯示，MPB64 抗原膠體金法結果與PNB生長實驗符合率高達99.32%，兩者對于臨床常見分離菌株的MTBC和NTM鑒定無明顯差異（P＞0.05）。兩者靈敏度一樣（99.63%），但MPB64 抗原膠體金法特異度高于PBN培養法，MPB64膠體金法特異度達到100%。這和國外學者的報道是一致的。Kumar、Nakamura等［4-5］對MPT64抗原檢測的研究，均得到100%的特異性。國內多篇文獻報道MPT64抗原檢測的特異性均是100%。劉忠華等［6］報道MPT64在臨床分離株中ELISA檢測靈敏度為97.3%，的特異度為100%。韓敏等［7］MPT64對結核分枝桿菌檢測的靈敏度為98.9%，NTM、真菌、細菌的特異度為100%。

本次研究傳統PNB培養法有1例菌株不生長，導致錯誤鑒定為MTBC。PNB生長試驗陽性對NTM有肯定意義，但陰性沒有否定意義。即在PNB上生長確定為NTM，而在PNB上不生長不一定不是NTM，因為部分NTM在PNB上也不生長。李國利等［8］曾對316株臨床分枝桿菌分離株進行PNB生長試驗，52株MTB菌株均為陰性，264株NTM 菌株中有31株（12%）為陰性。并非所有在PNB上不生長的分枝桿菌一定是MTBC。1例MPB64檢測假陰性結果可能的原因：（1）結核分枝桿菌中BCG的幾個亞株（Copenhagen株，Glaxo株，Pasteur株，Tice株）不產生 MPB64 蛋白［9］；（2）一些結核分枝桿菌分離株發生mpt 64編碼基因的突變，產生TGA終止碼，部分C末端區域缺失所致［10］。

綜上所述，MPB64抗原膠體金法與PBN法靈敏度無差異，而特異度MPB64 抗原膠體金法優于PNB培養法，并且MPB64 抗原膠體金法操作更簡便，并在15min內獲得可靠結果，可以在培養結果報陽的當天一起獲得鑒定結果，可作為結核分枝桿菌快速鑒別的有效方法之一。肺結核和非結核分枝桿菌肺病的用藥治療方案相差較大，NTM對抗結核藥物大多呈天然耐藥。羅氏培養聯合特異性蛋白MPB64膠體金檢測，可以在培養結果報陽的當天即可作出MTBC和NTM的初步鑒定，利于臨床明確診斷和盡快確定治療方向，減少臨床醫生因無鑒定結果而盲目經驗用藥，這對控制結核至關重要。且MPB64膠體金檢測特異性好，確診速度快，操作簡便，值得在各級結核病實驗室推廣。