單細胞轉錄組測序在胰腺領域中的研究進展

毛霄彤 鄒文斌 孫暢 廖專

海軍軍醫大學附屬長海醫院消化內科，上海市胰腺病研究所，上海 200433

【提要】 單細胞轉錄組測序是采用新一代基因測序技術對細胞群體中每一個細胞的轉錄組進行高分辨率檢測，以揭示生物組織中細胞的異質性。該技術在鑒定特定細胞標志物、發現細胞亞群和稀有細胞以及分析微環境中細胞間關系方面具有獨特優勢，目前在腫瘤、發育、干細胞、微生物、神經科學等研究領域被廣泛應用。

每個細胞都是與眾不同的獨立個體，很多細胞構成完整的組織，并最終形成功能及表型。常見的多細胞批量測序(bulk RNA-sequencing，bulk RNA-seq)通常對組織樣本或細胞群進行測定，容易使細胞間的差異被平均值所掩蓋，難以鑒別異質性群體中各個細胞亞群的轉錄組特征。單細胞轉錄組測序(single-cell RNA-sequencing，sc RNA-Seq)技術完美解決了這一問題，為研究群體中的不同類型細胞提供了可能。胰腺是一個由復雜細胞組成的器官,在內外分泌功能方面發揮重要作用。近年來胰腺領域開展的單細胞測序研究使人們對胰腺細胞類型、狀態和亞群的認識更為深入，并對病理狀態下的特定細胞轉錄組特征進行了精確描述。

一、胰腺的單細胞轉錄組特征

成熟胰腺可分為內分泌部和外分泌部，其中外分泌部約占胰腺的95%，主要由導管和腺泡細胞組成[1]。內分泌部胰島由5種內分泌細胞組成，包括α、β、γ、δ和ε細胞，分泌不同的激素。細胞標志物是識別細胞身份的重要工具，sc RNA-Seq對經典的胰腺細胞標志物進行了驗證，α、β、γ、δ和ε細胞分別用GCG、INS、PPY、SST、GHRL進行鑒別[2]。同時發現了一些新的候選標志物，如腺泡細胞特異性表達PRSS1、CPA1、CTRB1、REG1B，導管細胞表達KRT19。此外，ACTA2、PDGFRA可作為活化胰腺星狀細胞的特異性標志物，RGS5可作為靜止胰腺星狀細胞的鑒別標志物[3-4]。

sc RNA-Seq數據顯示，INS、PPY、SST的表達各占β、γ、δ細胞轉錄本約50%，而 GCG和GHRL的表達各占α和ε細胞轉錄本約20%[2]。不同物種的同一類型細胞轉錄譜存在差異，如α、β細胞中15%的高表達基因存在物種特異性[5]。多個研究報道了人類胰島中同時表達α和β細胞標志基因的“中間細胞”，但沒有排除這是兩個細胞的轉錄組同時被捕獲的可能[2,6]。

γ、δ、ε細胞是稀有內分泌細胞，人們對這3類細胞的轉錄組特征了解有限。Digruccio等[7]發現小鼠δ細胞表達的部分受體與β細胞相一致，而Sstr1和Ghsr的表達僅限于δ細胞。多個研究將瘦素受體鑒定為δ細胞特異性受體[2-3,8-9]，表明δ細胞在調節食物攝入和能量平衡方面發揮重要作用。人類γ細胞除表達TPH1、SERTM1、SPOCK1、ABCC9和SLITRK6外，還表達高水平的轉錄因子MEIS2、ETV1、ID4和FEV，提示γ細胞與神經元細胞存在相似性[2-3,9-10]。Segerstolpe等[2]發現ε細胞表達NPY1R、OPRK1、PTGER4和ASGR1等特異性受體基因。

二、sc RNA-Seq在胰腺發育領域的研究

為研究胰腺胚胎發育過程中的單個細胞變化特征，研究者對胚胎日(embryonic day，E)12.5、E13.5、E14.5、E16.5和E17.5的小鼠胚胎胰腺及早期人類胎兒胰腺進行了sc RNA-Seq[11-14]。

內分泌祖細胞(endocrine progenitors，EPs)是胚胎胰腺中的一種瞬時細胞類型，能產生5種內分泌細胞，Ngn3的表達是EPs形成的必要條件。Scavuzzo等[12]利用sc RNA-seq技術在E14.5胰腺中鑒定出了4個Ngn3陽性細胞亞群，代表EPs的不同成熟階段。與E14.5的EPs不同，E16.5的EPs具有更高的β細胞形成傾向。Byrnes等[13]對小鼠胰腺胚胎發育時期的間皮和間質細胞進行了精確分析，發現了一群特征性表達Fev的EPs 。Krentz等[15]對E15.5、E18.5的小鼠胰腺細胞和人類胚胎干細胞(human embryonic stem cells，hESCs)衍生的EPs進行分析，探究了β細胞從hESCs來源的可能性。

為了研究α、β細胞的發育軌跡，Qiu等[16]對小鼠胎兒到成體不同發育階段的α、β細胞進行了sc RNA-Seq分析。測序結果發現，α細胞和β細胞分別存在448和664個動態調節的基因，表明這兩類細胞在成熟過程中使用不同的調節策略。早期β細胞異質性反映了不同的起源、周期階段和成熟狀態，而成體β細胞的轉錄水平相對均一。Zeng等[17]對不同發育階段β細胞進行擬時序分析，揭示了增殖期β細胞的轉錄特征以及調節氨基酸代謝、線粒體呼吸和活性氧產生的相關基因轉錄水平變化。

三、sc RNA-Seq在糖尿病領域的研究

單細胞研究拓展了β細胞在病理狀態下的異常基因表達譜。Baron等[3]發現糖尿病β細胞中內質網應激相關基因表達減少，提示β細胞異質性消失。Wang等[18]確定了3個不同β細胞亞群,其中2個亞群表達細胞增殖相關基因Ki67，其比例在是否患2型糖尿病(type 2 diabetes，T2D)、不同年齡和身體質量指數的人群中存在差異。Segerstolpe等[2]根據RBP4和GPR120鑒定出2個β細胞亞群，其中RBP4促進胰島素抵抗，GPR120參與誘導胰島素分泌。

T2D患者和健康人群胰島的sc RNA-Seq數據提示β細胞在病理狀態下存在去分化現象。T2D患者的β細胞表現出幼年內分泌細胞的轉錄特征，伴隨CDKN2B、BARD1、JUNB和PRKD1的表達增加[6]，而INS轉錄水平相比于健康對照組顯著降低[2]。這些發現表明T2D患者的β細胞不能維持完全分化的基因表達譜，繼而影響內分泌功能。

sc RNA-Seq研究發現健康人群和T2D患者的胰島α細胞存在200個差異表達基因，不同研究間差異基因的重疊率為35%[1]。單細胞測序對罕見的增殖性α細胞進行鑒定和轉錄分析[2,6,16]，Wang等[6]鑒定出高表達Ki67的單個增殖性α細胞，其表現為細胞周期途徑的激活和細胞周期檢查點控制基因的抑制。

四、sc RNA-Seq在胰腺腫瘤領域的研究

Bernard等[19]對2個低級別胰腺導管內乳頭狀黏液腫瘤(intraductal papillary mucinous neoplasm，IPMN)、2個高級別IPMN和2個胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)樣本進行sc RNA-Seq，通過不同階段的分析揭示了PDAC逐漸進展的轉錄組變化。Peng等[4]繪制24個原發性PDAC和11個對照胰腺樣本的單細胞轉錄圖譜，發現PDAC內腫瘤細胞具有異質性和調節PDAC進展的關鍵因素。此外，該研究通過特征性基因表達譜分離出了惡性導管細胞群，并發現具有高度增殖和遷移能力的亞群。

腫瘤相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)是PDAC進展和耐藥性的主要參與者。Elyada等[20]用sc RNA-Seq研究人和小鼠PDAC的腫瘤微環境，證實了肌纖維母細胞樣CAF和炎性CAF的存在，并定義了它們獨特的基因特征。此外，研究者發現了表達組織相容性復合體MHC Class Ⅱ和CD74的CAF群，將其定義為“抗原呈遞CAF”，它們以抗原呈遞方式激活CD4+T細胞，從而發揮免疫調節作用。

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