中國兒童谷氨酸脫氫酶型先天性高胰島素血癥臨床及遺傳學特征分析

呂葛 徐子迪 惠培培 曾俏 劉敏 閆潔 吳玉筠 桑艷梅

1國家兒童醫學中心，首都醫科大學附屬北京兒童醫院檢驗中心，北京 100045；2國家兒童醫學中心，首都醫科大學附屬北京兒童醫院內分泌遺傳代謝中心，北京 100045

先天性高胰島素血癥(congenital hyperinsulinism, CHI)是一種遺傳異質性疾病，由于胰島素自律性分泌過多，血胰島素濃度增加，從而導致出生后出現頑固性、持久性低血糖的表現，是嬰幼兒和兒童時期持續性、復發性低血糖的重要原因。迄今已發現至少14種基因突變與CHI的遺傳發病機制有關，表現為13種遺傳學類型，不同類型CHI患兒的臨床特征、治療方案、治療效果及預后不盡相同[1-4]。谷氨酸脫氫酶型先天性高胰島素血癥(glutamate dehydrogenase hyperinsulinism, GDH-HI)是CHI的第2種常見類型，由編碼線粒體酶谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase，GDH)的GLUD1基因功能增強性突變引起。本研究分析10例GDH-HI患兒的臨床及遺傳學特征，以期提高臨床醫師對該病的認識。

資料和方法

一、研究對象

選取2008年2月至2018年12月間北京兒童醫院收治的10例臨床初步診斷為GDH-HI患兒家系為研究對象。CHI診斷指標包括高胰島素血癥(胰島素>2 mU/L)、低脂肪酸血癥(游離脂肪酸<1.5 mmol/L)、低酮血癥(β-羥丁酸<2.0 mmol/L)、1 mg靜脈胰高血糖素試驗反應血糖變化>0.3 g/L[5]。本研究經醫院倫理委員會批準，所有患兒父母均簽署知情同意書。

二、遺傳學分析

留取患兒及父母的血液標本3 ml，采用BloodGen Midi Kit(CWBIO，中國)提取患者全基因組DNA，然后分別應用聚合酶鏈反應DNA(PCR-DNA)直接測序技術(病例1、3、4和5)和二代測序技術(其余6例病例)進行相關致病基因分析。

PCR-DNA直接測序：利用Premier5.0軟件設計用于擴增GLUD1基因第6、7、10、11、12外顯子區域的引物(表1)。PCR反應體積為50 μL，含5×GoTaq緩沖液10 μL、2.0 mmol/L Mg2+、0.2 mmol/L dNTP、正反向引物各1 μmol/L，1.25 U熱啟動Taq酶(美國Promega公司)。在Labnet熱循環儀(美國Labnet公司)擴增，PCR反應條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s、58～62℃ 30 s，72℃ 45 s，循環38次，最后72℃ 5 min。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分離、回收片段，采用天根公司膠回收試劑盒純化產物，由北京英俊公司行直接測序。

表1 GLUD1基因擴增引物序列

二代測序：參考OMIM數據庫信息[1-4]，將與低血糖相關的基因組外顯子區通過捕獲探針(SeqCap EZ MedExome Enrichment Kit 探針，瑞士羅氏公司)進行目標基因全外顯子捕獲，經Illumina hiseq XTen平臺標準化上機測序。若經二代測序發現患兒攜帶GLUD1基因突變，則根據基因所驗證位點序列設計引物，采用PCR方法進行擴增，引物序列及擴增條件同上，擴增產物純化后上ABI 3730XL測序儀測序，采用DNASTAR軟件進行基因序列分析和比對。

結 果

一、臨床特征

10例患兒中男性8例，女性2例，出生體重為2.65～4.25 kg；9例為足月適齡兒，1例為巨大兒；發病年齡為出生后1 d～14個月，中位年齡為8個月。8例患兒首發癥狀為抽搐，2例首發癥狀為反應弱。患兒均無低血糖家族史。10例患兒血糖為1.40～2.60 mmol/L，均低于正常值；血胰島素為3.54～45.02 mU/L，均高于正常值；9例伴有無癥狀性高氨血癥(血氨正常值為18～72 μmol/L)，1例患兒(病例7)血氨正常，為巨大兒。10例患兒確診為CHI后，其中9例予以二氮嗪試驗性治療。二氮嗪起始劑量為5 mg·kg-1·d-1，每日2～3次口服，并根據患兒病情逐漸增加劑量，最大劑量為15 mg·kg-1·d-1。同時加用氫氯噻嗪利尿(1～2 mg·kg-1·d-1，分2～3次口服)，防止水鈉潴留，并加用10%氯化鉀1～2 ml· kg-1·d-1，分3次口服，防止利尿劑引起的低鉀血癥。9例患兒均對二氮嗪治療有效。另1例未進行治療(表2)。

二、遺傳學特征

10例患兒均發現攜帶GLUD1基因(NM_005271.5)突變，均為錯義突變。病例1攜帶c.1388A>T突變，致p.N463I(外顯子10)，為新生突變；病例2攜帶c.1495C>A突變，致p.G499C(外顯子12)，為新生突變；病例3、4、7、9、10均攜帶c.965C>T突變，致p.R322H(外顯子7)，其中病例3為父系常染色體顯性遺傳，其余均為新生突變；病例5攜帶c.1493C>T突變，致p. S498L(外顯子11)，為新生突變；病例6攜帶c.1519G>A突變，致p.H507Y(外顯子12)，為新生突變；病例8攜帶c.1388A>G突變，致p.N463S(外顯子10)，為新生突變(表2)。

三、隨訪結果

經過長期隨訪，1例患兒確診CHI后未曾試用二氮嗪治療，通過口服葡萄糖維持正常血糖水平，在11歲左右病情自行緩解。曾用二氮嗪治療的9例患兒中7例繼續口服二氮嗪治療，可維持正常血糖，其中2例同時患有癲癇；2例患兒失訪(表2)。

表2 10例谷氨酸脫氫酶型先天性高胰島素血癥患兒臨床資料和預后情況

討 論

GDH-HI是CHI的第2種常見類型，約占CHI的5%。1956年Cochrane等[6]首次報道了高蛋白飲食(尤其是亮氨酸)可導致低血糖，當時命名為“亮氨酸敏感性低血糖”。1998年Stanley等[7]首次描述了GDH-HI，也稱為高胰島素血癥-高氨血癥綜合征(hyperinsulinism-hyperammonemia syndrome，HI-HA)，是由線粒體基質酶中GDH的功能增強性突變引起的疾病。GDH由GLUD1基因編碼， 是一種別構蛋白，為六聚體結構。成熟的GDH由兩套三聚體組成，在每個三聚體中，酶的亞單位通過突出的觸角樣結構域結合在一起，使酶的各亞單位之間相互協調一致。GLUD1基因位于染色體10q23.3，含有13個外顯子，編碼505個氨基酸。

GDH-HI發病年齡跨度較大，患兒絕大多數在出生后4個月或以后，新生兒期發病者少見，也有部分為成年后才確診。出生體重多正常。臨床表現多為低血糖癥狀，如無明顯誘因的抽搐、口唇青紫、口周發青、肌張力減弱、反應減弱、嗜睡等?；純旱牡脱前Y狀可由空腹和高蛋白(尤其是亮氨酸)飲食誘發。本研究10例患兒的發病年齡為出生后1 d至14個月，9例患兒出生體重正常，與文獻報道基本一致[8-9]。

隨著研究的不斷深入，迄今已發現了37種GLUD1基因雜合突變，目前僅報道過1例GDH-HI患兒同時攜帶母系遺傳的移碼突變(c.37delC)和新生突變c.1493C>T(p. S498L)，其余突變類型集中在第6、7、10、11、12外顯子區的錯義突變[10]。突變位于外顯子11、12者約占48%，位于外顯子6、7者約占29%。本研究10例患兒共發現了6種GLUD1基因突變類型，其中攜帶GDH外顯子7 p.R322H突變者占50%(5/10)，攜帶外顯子11、12突變者占30%(3/10)，攜帶外顯子10突變者占20%(2/10)，提示GDH p.R322H可能是中國GDH-HI患兒的熱點突變類型。本組患兒的突變分布比例與國外文獻報道有所不同，考慮與樣本量較小或人種差異有關。 GDH-HI的遺傳方式為常染色體顯性遺傳或新生突變，其中常染色體顯性遺傳約占20%，新生突變約占80%[11]。 本研究10例患兒中9例為新生突變，1例為父系遺傳的常染色體顯性遺傳，遺傳方式與既往報道一致[2]。

GDH-HI除可引起患兒頻發的低血糖，一般還伴有無癥狀性、持續性高氨血癥(可達正常值上限的3～5倍)?；純旱母哐敝挡粫虻脱前l作、高蛋白飲食而升高，也不會因限制蛋白飲食或二氮嗪治療而降低，但并非所有的GDH-HI患者均存在高氨血癥[12]。產生高氨血癥的機制主要包括：(1)GDH活性增強，導致谷氨酸產生的氨增加。(2)谷氨酸的消耗增多，減少N-乙酰谷氨酸的產生，而后者是氨解毒第一步所必需的變構活化劑。注射N-乙酰谷氨酸的類似物N-氨基甲酰谷氨酸可降低血氨，以此可證明該機制的存在[13]。本研究10例中9例表現出高氨血癥，1例血氨值正常。2001年Santer等[14]曾報道2例攜帶GDH p.R322H突變的患兒，其血氨值均正常，此現象的發生可能是由于患兒為GLUD1基因突變的嵌合體(突變細胞與正常細胞并存)，在肝臟組織中該基因突變缺失或突變率<50%。相關研究結果提示高氨血癥并不具有基因特異性，但是需要進一步進行肝臟或胰腺活檢來證明這種可能性[13]。

文獻報道，46%～64%的GDH-HI患兒可伴有癲癇，他們的基因突變多發生在外顯子6和7[13]，攜帶GDH外顯子10、11、12的患兒也可發生癲癇，癲癇最早可在新生兒時期出現[15]。本研究中2例患兒患有癲癇，病例2于低血糖發病1個月后(2月齡)確診癲癇，病例9于低血糖發病3個月后(9月齡)確診癲癇，突變類型分別為GDH p.R322H和p.G499C，分別位于GDH的第7和12外顯子，這種不同突變位置與基因型-表現型的相關機制尚不明確。

因患兒胰腺β細胞的ATP敏感性鉀通道是正常的，故絕大多數GDH-HI患兒對二氮嗪治療有效[16-18]，目前尚未發現有文獻報道二氮嗪治療無效的GDH-HI。本研究 10例中9例試用二氮嗪治療，均有效，與上述文獻報道一致。GDH-HI患兒建議給予低蛋白飲食作為輔助治療，每餐亮氨酸≤200 mg可有助于降低二氮嗪的用量[19]。

本研究8例經過長期隨訪，其中7例患兒均繼續服用二氮嗪進行治療，可維持空腹血糖正常。長期應用二氮嗪過程中，除部分患兒有多毛表現外，未見其他藥物不良反應。研究資料顯示，隨著CHI患兒的年齡增長及其對胰島素需要量的增加，其低血糖癥狀可有所減輕，部分患兒可自愈。有研究對101例CHI患兒隨訪發現，約48%的CHI患兒低血糖可自行緩解，且自行緩解的時間跨度較長(3個月至8歲左右)；在未檢測出已知致病基因突變的患兒中，約65%患兒可自行緩解。而自行緩解的患兒中約15%是ATP敏感性鉀離子通道型先天性高胰島素血癥(由ABCC8或KCNJ11基因突變導致)，另有4%的患兒攜帶GLUD1、GCK或HNF4α基因突變[20]。本組1例患兒未試用二氮嗪，間斷口服葡萄糖溶液來維持血糖正常，于11歲時低血糖癥狀自行緩解，提示攜帶GDH-HI突變的患兒存在自行緩解的可能性。

總之，中國兒童GDH-HI的臨床特征和遺傳學特征與其他人種相比差異并無統計學意義，但GDH p.R322H突變為中國兒童GDH-HI的熱點突變類型。GDH-HI患兒多對二氮嗪治療有效，部分患兒可出現癲癇。隨著病程的進展，少數患兒存在自行緩解的可能。值得一提的是，少數患兒血氨可正常，臨床須注意避免漏診。細致的致病基因分析對患兒的遺傳學分型、診療方案的確立、隨訪、預后的判斷和遺傳咨詢等均有重要意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突