熱休克蛋白70在急性胰腺炎中的作用及其研究進展

陳燕 杜奕奇

海軍軍醫大學附屬長海醫院消化內科，上海 200433

【提要】 熱休克蛋白70(HSP70)在急性胰腺炎(AP)時通過同時抑制胰蛋白酶原和NF-κB炎癥通路的激活來發揮胰腺腺泡細胞的損傷保護作用；HSP70多態性可能與AP患者病情嚴重程度存在關聯，激動過氧化物酶體增殖物激活受體γ可能通過增加腺泡細胞內熱休克因子1 /HSP70的激活轉錄減輕AP嚴重程度，而激動劑的可選擇性可能為臨床選擇藥物救治AP提供安全、有效的可能。

1962年，Ritossa[1]在實驗中偶然發現了一個現象，即在較高溫度下孵化的果蠅唾液腺中的核酸合成增加。由于該現象發生在細胞暴露于高溫下時，他便提出“熱休克反應”這個術語。最初發現的熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)的分子質量都在70×103范圍以內，隨后發現了與熱休克反應相關的多個蛋白，分子質量為(15～110)×103[2-4]。接著在多個亞細胞結構(如線粒體、內質網)中發現了這些HSP，分子質量大的HSP依賴于ATP，在常溫或應激溫度下表達，具有一系列不同的功能，包括蛋白質折疊和轉位、細胞保護及調節凋亡等[5]；分子質量較小的HSP通常有組織特異性，不依賴ATP，具有蛋白質折疊伴侶和抗凋亡功能[6]。HSP家族中最保守和研究最充分的是HSP70超家族。它們依賴ATP，分子質量為(66～78)×103，由一組11個人類基因編碼。這些蛋白的水平受熱休克因子(heat shock factor，HSF)的轉錄調控。HSF由HSF1、HSF2、HSF3和HSF4組成，它們的功能相互獨立又相互重疊，表達模式具有組織特異性。其中，HSF1是主要的轉錄調節因子，是HSP基因反式激活和維持耐熱性所必需的[7]。HSF1在應激期間被誘導與HSP70的啟動子結合以增加其轉錄。可誘導的HSP70對廣泛的刺激敏感，具有良好的治療潛力。本文就其在急性胰腺炎(AP)中的作用及其研究進展進行綜述。

一、AP的酶原激活理論

AP是一種胰腺炎癥疾病，最終導致腺泡細胞損傷和死亡。在生理條件下，消化酶由胰腺腺泡細胞合成、儲存和分泌，各種保護機制使消化酶在腺泡細胞內免于被激活[8]。然而，在AP期間各種刺激導致消化酶酶原在腺泡細胞內被激活，進而也激活了腺泡細胞死亡和炎癥反應途徑[9]。研究表明，在AP早期消化酶酶原與溶酶體融合，胰蛋白酶原被激活為胰蛋白酶[10-11]。與此同時，NF-κB依賴的促炎途徑被激活，導致炎癥細胞因子從腺泡細胞釋放，從而放大胰腺局部和全身多器官的損傷[12]。

二、HSP70對胰腺腺泡細胞的保護作用及其機制

HSP70在AP體內外實驗中通過以上發病機制發揮其保護作用。這些研究主要通過熱應激和非熱應激(化學應激源，如β-腎上腺素、亞砷酸鈉等非熱藥物)使胰腺腺泡細胞過表達HSP70實現的。Wagner等[13]發現，當大鼠胰腺的腺泡細胞暴露于熱應激時，分子質量為72×103的HSP70表達明顯增加；進一步觀察到HSP70的過度表達對雨蛙素誘導的AP大鼠器官損傷具有保護作用，且HSP誘導的強度與器官損傷保護程度密切相關。除熱應激外，通過非產熱方法誘導HSP70過表達的AP模型中也觀察到類似的保護作用。β-腎上腺素誘導HSP70過表達可保護小鼠免受雨蛙素誘導的AP胰腺損傷，同時阻止胰蛋白酶原早期激活[14]。亞砷酸鈉誘導的HSP70過表達在雨蛙素以及L-精氨酸誘導的AP模型中也提供保護作用，表現為高淀粉酶血癥、胰腺水腫和腺泡細胞壞死程度明顯減輕；亞砷酸鈉預處理不僅能抑制胰蛋白酶原活化，而且在體內和體外都能通過抑制IκBα的降解阻止NF-κB向細胞核的轉位[15]。AP的酶原激活機制認為消化酶酶原和溶酶體酶共定位是腺泡內胰蛋白酶激活所必需的。HSP70保護腺泡細胞的機制之一就是干擾酶原顆粒和溶酶體酶的共定位[15]。共定位需要Ca2+內流的初始激增以及隨后的持續增加，細胞內Ca2+的螯合可以抑制共定位[16]。對非胰腺細胞的研究發現HSP70可以減弱細胞內Ca2+的增加[17]。除了抑制腺泡細胞內胰蛋白酶原的激活外，HSP70的過表達還通過增加其內源性抑制劑IκBα的水平來降低NF-κB的激活[18]。這些研究證明了HSP70對AP的腺泡細胞損傷具有保護作用，這種保護作用通過同時抑制胰蛋白酶原活化和NF-κB激活實現，且與HSP70的誘導方式無關。

值得一提的是，雖然熱應激和化學藥物誘導的主要蛋白是HSP70，但這些干預也誘導了其他多種HSPs，因此這些干預所觀察到的保護作用是否是HSP70過表達之外的事件引起的，Bhagat等[19]對此進行了研究。他們在體外實驗中用反義寡核苷酸和藥理兩種方法抑制HSP70過表達，發現雨蛙素誘導的AP胰腺損傷中未出現保護作用，說明對雨蛙素誘導的胰腺保護作用是由熱應激后的HSP70介導的；然后他們在體內實驗中進一步證明了HSP70對胰腺損傷的保護作用，即在熱應激前給予抑制HSP70的反義寡核苷酸，此時有其他應激蛋白表達，但HSP70未表達，對雨蛙素誘導的胰腺損傷也失去保護作用，表明這種保護作用是通過過表達的HSP70介導的；但在熱應激前給予HSP70的正義寡核苷酸組，熱應激對雨蛙素誘導的AP保護作用仍然存在，因為HSP70的過表達未受到影響。該項研究說明，熱應激等干預手段對雨蛙素誘導的AP保護作用就是通過誘導HSP70過表達實現的。

三、HSP70多態性預測AP嚴重程度

人類編碼HSP70的主要基因(即HSP70.2)A～G多態性導致誘導性HSP70.2 mRNA表達水平較低(即HSP70.2基因中具有純合G等位基因)。Balog等[20]發現HSP70多態性與AP嚴重程度之間存在關聯。與輕癥AP組(29例)、健康對照組(71例)相比，重癥AP組(48例)中有較多的患者具有HSP70.2G等位基因多態性，認為HSP70.2G等位基因的高頻率與重癥AP的發病風險相關。HSP70水平或多態性未來可能有助于預測AP嚴重程度和患者預后，基因型評估也可用于指導治療或識別重癥AP的危險人群。而Srivastava等[21]對50例AP患者和50例健康獻血員進行前瞻性研究，同樣用PstI限制性片段長度多態性方法確定HSP70.2基因的3個等位基因(AA、AG和GG)。結果發現AP患者HSP70.2G等位基因頻率明顯高于對照組。然而，該多態性與疾病嚴重程度和并發癥均無關。筆者認為上述2項研究病例數量少是主要缺陷，在這方面，中國AP患者例數顯示出研究優勢，但目前缺乏中國人群相關數據。

四、HSP70在AP研究中的進展

如上所述，HSP70在AP的體內外實驗和臨床試驗中都表現出胰腺保護能力。除此之外，有研究者認為HSP70基因評估也可用于指導治療或識別重癥AP的危險人群。但在臨床實際應用方面，HSP70至今沒有用作預測指標，目前也缺乏誘導HSP70表達的藥物。

HSP70用作臨床預測指標困難與其生物學特性有關：即正常情況下HSP70在細胞內(胞核、胞質或亞細胞結構)呈基礎表達水平；而在高溫、化學藥物及各種有害應激狀態下，HSP70在細胞內的合成速度顯著增加，以提高生物體的抗應激和抗炎能力，在這些體內外實驗中，檢測HSP70均在細胞水平，且HSP70的過表達對細胞和器官均有保護作用[13-15，22-24]。因此，如果在AP患者血液、體液檢測中發現較高表達水平的HSP70，表明病情可能較重。HSP70的保護作用發生在細胞水平，如果細胞損傷甚至壞死，腺泡細胞內的HSP70釋放，甚至會和高遷移率族蛋白1(high-mobility-group box 1，HMGB1)一樣成為潛在的損傷相關分子(damage associated molecular pattern，DAMP)[18,25-26]。近期有研究報道重癥AP患者血清中HMGB1濃度升高，伴有炎癥因子的增加，而HSP70濃度降低，因而認為HSP70是保護性蛋白[27]。而我國學者曾發現胰腺腺泡細胞外給予HSP70可在小鼠體內誘導全身炎癥反應綜合征(SIRS)，其中Toll樣受體-4可能參與激發HSP70介導的SIRS[18]。這兩項無法相互解釋的研究也側面說明HSP70研究的復雜性，以及其不能作為預測指標的原因。實際上，在細胞水平，HSP70通過多種機制抑制SIRS，其中之一就是減少HMGB1的細胞外分泌和釋放[23-24]。

在誘導胰腺腺泡細胞內生成HSP70方面，如前所述亞砷酸鈉是灰白色的固體，易溶于水，有劇毒，主要用于農藥和殺蟲劑。而β腎上腺素主要作用于心臟、血管平滑肌和支氣管平滑肌的β受體，小劑量即可興奮心臟β1受體，產生正性肌力作用，用于心臟驟停、過敏性休克的救治，使用β腎上腺素誘導腺泡細胞HSP70表達時會有較明顯的藥物不良反應。如前所述，HSF1在應激狀態時被誘導與HSP70的啟動子結合以增加其轉錄合成。Bhagat等[19]發現HSF1基因敲除小鼠的HSP70合成減少，小鼠表現為更嚴重的AP。因此，增加HSF1/HSP70激活轉錄即能誘導腺泡細胞內HSP70過度表達，而如何激活HSF1目前在AP研究中尚未涉及。在心肌細胞再灌注損傷中，研究者發現使用過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)的天然配體15d-PGJ2可以增加HSF1的DNA結合并上調HSP70的合成，從而發揮保護心肌細胞的作用；而PPARγ的合成激動劑吡格列酮也能減輕心肌細胞損傷和NF-κB炎癥通路的激活[28]。有研究發現吡格列酮可以調控AP胰腺腺泡細胞線粒體功能，發揮保護腺泡細胞的作用[29]。筆者推測激動PPARγ可能通過增加腺泡細胞內HSF1/HSP70的激活轉錄減輕了AP嚴重程度。另一方面，PPARγ激動劑的可篩選性也為臨床選擇藥物救治AP提供安全、有效的可能。

綜上所述，HSP70通過抑制胰蛋白酶原的腺泡內激活和NF-κB炎癥通路的激活來介導胰腺腺泡細胞的損傷保護，HSP70的保護作用只發生在細胞水平，如果發生細胞損傷甚至壞死，腺泡細胞內的HSP70則有可能成為潛在的DAMP，實驗誘導HSP70過表達的藥物具有較高的不良反應，PPARγ激動劑的多品種化提供臨床選擇合適治療藥物的可能。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突