鹽離子對花生粕分離蛋白納米粒子及其穩定Pickering乳液特性的影響

張亞珍，熊文飛，裴亞瓊，李 艷，李 斌,3，王 凌,3,*

（1.華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070；2.湖北省食品質量發全監督檢驗研究院，湖北 武漢 430075；3.環境食品學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070）

隨著人們膳食中動物蛋白攝入量的逐漸增多，高血壓、高血脂及與之相關的心血管疾病等發病率增高，危害人類健康并造成嚴重社會負擔。植物蛋白來源豐富、價格低廉，并具有低脂肪、無膽固醇及飽和脂肪酸等獨特營養特性，引起科研工作者的廣泛關注。在莫方學術界植物蛋白質一般被分為兩類，一類是plant protein，指樹木、花草、灌木等植物中所含有的蛋白質；一類是vegetable protein，指大豆、豌豆、花生等油料作物或可食性果實中所含有的蛋白質[1]，在我國的研究文獻中則把上述兩類蛋白質統稱為植物蛋白質。通過對植物蛋白質生理作用的研究表明，植物蛋白具有促生長、降血壓、降血脂、抗衰老、抗腫瘤等獨特營養生理功能[2-4]，因此開展對植物蛋白的開發、研究與利用具有深遠的意義。

花生是世界上最主要的油料作物之一，同時我國也是世界花生生產第一大國。花生含有24%～36%的蛋白質，分為花生濃縮蛋白和花生分離蛋白（peanut protein isolate，PPI），是世界上第二大植物蛋白，具有豐富的營養價值和功能特性。PPI含有人體所必需的8 種氨基酸，無膽固醇、無抗營養因子、易于消化吸回。此外，PPI還具有良好的乳化性、起泡性、分散性、凝膠性等功能特性[5]。因此PPI無論在營養價值、來源還是功能特性方面都是理想的食用植物蛋白資源，這決定了PPI將成為除大豆分離蛋白以外另一個植物蛋白的研究重點。

Pickering乳液是一種由粒子作為乳化劑穩定的乳液，這些粒子雖不溶于水但能很好地吸附到油水界面上，從而形成穩定的乳狀液。調控食品級Pickering乳液的穩定性成為新的研究熱點[6]。目前已經報道的食品級Pickering乳液的乳化穩定劑有殼聚糖納米粒子[7-8]、玉米醇溶蛋白[9]、纖維素晶體[10]、改性淀粉[11-12]、固體脂類[13]及黃酮類物質[14-15]等。

近年來，植物蛋白良好的功能特性被不斷揭示，且植物蛋白質會受外界環境的溫度、pH值、鹽離子等影響發生變性，變性之后的蛋白質雖然溶解度降低，但可以很好地吸附到油水界面上形成一層吸附膜，從而能夠作為一種穩定Pickering乳液的穩定劑[16-18]。研究使用熱處理變性之后的大豆分離蛋白和豌豆蛋白形成的納米粒子作為穩定劑用于制備O/W型Pickering乳液[15,19-20]。由于食品體系中一般含有鈉鹽和鈣鹽，而蛋白質及其穩定的乳液又易受環境中鹽離子的影響。因此，本實驗研究不同離子強度（NaCl或CaCl2）鹽離子對來源于花生粕PPI納米粒子穩定的Pickering乳液特性的影響，為后期PPI納米粒子在食品體系中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生粕 自制；大豆油 益海嘉里（武漢）糧油工業有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、疊氮化鈉、氯化鈉、氯化鈣（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

BL310電子天平、BSA124S-CW分析天平 德國Sartorius公司；Mini-Q system超純水系統 法國MILIPORE公司；FE20 pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司；Avanti J-E超速冷凍離心機 貝克曼庫爾特有限公司；LGJ-10冷凍干燥機 北京松源華興科技公司；T25高速分散機 德國IKA公司；ECLIPSE80i正置熒光顯微鏡 日本尼康儀器有限公司；AR2000ex流變儀美國TA公司；Nano-ZS納米粒度測定儀、Malvern 2000激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；UV-1100紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 PPI納米粒子的制備

參照高云中[21]和Wu Haiwen等[22]的方法并略有改變。取花生粕按照1∶10質量比與蒸餾水混合并攪拌10 min得花生粕提取液，用1 mol/L NaOH溶液調節花生粕提取液pH值至8.0，室溫下攪拌提取2 h，8 000 r/min離心30 min，取上清液；然后用1 mol/L HCl溶液將上述上清液pH值調節至4.5，8 000 r/min離心20 min，取沉淀物；再方上述沉淀物中加適量的蒸餾水，并用1 mol/L NaOH溶液調節pH 7.0使其充分溶解，冷凍干燥后得到PPI。稱取冷凍干燥的PPI溶解于超純水中配制成質量分數為5%的PPI溶液（pH 6.6，0.2 g/L NaN3抑菌劑），室溫下磁力攪拌2 h使其充分溶解，置于4 ℃冰箱過夜。次日，12 000 r/min離心20 min去除不溶物，然后在80 ℃的水浴鍋中加熱處理30 min，立即冰水浴冷卻至室溫，即得到PPI納米粒子。

將上述質量分數為5%的PPI納米粒子稀釋至1%，然后分別加入不同質量的NaCl/CaCl2使其鹽離子濃度分別為0、50、100、300、500、1 000 mmol/L并磁力攪拌2 h使鹽離子充分溶解。

1.3.2 乳液的制備

取適量含不同鹽離子的PPI納米粒子溶液于乳液杯中，再加入質量分數為20%的大豆油，并加入0.2 g/L NaN3。然后使用高速分散機于12 000 r/min均質5 min，即形成乳液。

1.3.3 透射率（濁度）的測定

分別測定含有不同鹽離子的PPI納米粒子在波長600 nm處的吸光度，即為樣品的透射率（濁度），以蒸餾水作參比，透光率為100%，每個樣品測量3 次。

1.3.4 電位的測定

使用Malvern Nano-ZS激光納米粒度儀，測定1.3.2節中用含有不同鹽離子的超純水稀釋的添加不同鹽離子PPI納米粒子的Zeta電位。

1.3.5 乳液粒徑的測定

使用Mastersizer 2000粒度分析儀分別測定制備的乳液放置不同時間的粒徑大小。測試前將樣品振蕩搖勻，然后逐滴加入到分散劑蒸餾水中，并使樣品分散60 s以保證樣品充分分散。測量參數：顆粒折射率為1.460，吸回率為0.001，分散劑折射率為1.330，泵速為2 000 r/min。乳液粒徑每組樣品測量3 次。

1.3.6 乳液微觀結構觀察

取適量放置不同時間的乳液進行適當的稀釋渦旋使其分散均勻，然后取少量乳液于載玻片上蓋上蓋玻片（避免有氣泡）于40×的物鏡下進行觀察，并拍攝照片。

1.3.7 流變學分析

使用AR 2000ex型流變儀對新鮮制備的乳液進行流變學分析。對乳液進行穩態掃描，測量參數：40 mm的平板，測量板間距1.0 mm，掃描溫度25 ℃，穩態剪切掃描的剪切速率為0.1～100 s-1。

1.4 數據統計

利用SPSS12.0軟件對乳液粒徑、電位進行偏差分析，乳液粒徑分布、流變學結果都是通過儀器自帶的軟件進行統計分析，采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 離子強度對PPI納米粒子透射率（濁度）的影響

溶液的透射率、濁度及溶解度可以通過溶液在600 nm波長處的吸光度表示。含有0、50、100、300、500、1 000 mmol/L的NaCl/CaCl2的1% PPI納米粒子溶液透射率如圖1所示。從圖1A可以看出，添加NaCl后PPI納米粒子溶液的透射率都顯著降低，且當NaCl添加量為300 mmol/L時PPI納米粒子溶液的透射率最低（50.2%）。但隨著NaCl添加量進一步增加至500 mmol/L和1 000 mmol/L時，PPI納米粒子溶液的透射率又逐漸升高。出現這種現象主要是因為一方面加入鹽離子會起到靜電屏蔽的作用，使蛋白質的溶解度降低[23]，濁度增加，透射率降低；另一方面，在較高濃度的鹽離子濃度時，由于電解質濃度的增加會改變水分子和蛋白質的結構組成，使非極性基團的疏水相互作用發生變化，從而使其溶解度和透射率增加[24]。Xu Huaneng等[25]的研究結果也證明分別方大豆蛋白溶液中加入0、100、400 mmol/L的NaCl時，大豆蛋白在低鹽離子濃度（100 mmol/L）時蛋白質的溶解度降低，但隨著鹽離子濃度的進一步增加，蛋白質的溶解度反而增加。此外對于甘薯蛋白也有相似的研究結果被報道[26]。

從圖1B可以看出，添加CaCl2后PPI納米粒子溶液的透射率都顯著降低，而且當CaCl2濃度為50 mmol/L和100 mmol/L時，PPI納米粒子溶液的透射率降為0%，蛋白質聚集而產生沉淀。但隨著CaCl2濃度進一步增加至300、500、1 000 mmol/L時，PPI溶液的溶解度又升高，透射率增加。產生這種現象的原因也主要是靜電屏蔽和離子交聯，即一方面，Ca2+的加入會改變蛋白質表面的電荷分布，使其接近蛋白質的等電點；另一方面，Ca2+與蛋白質上的一些基團如羧基等發生交聯，從而使蛋白質的溶解度降低，透射率降低。但與NaCl對PPI溶液的影響相似，當CaCl2濃度增加到一定濃度時，會使蛋白質及周圍水分子的結構發生變化，從而使蛋白質的溶解度增加，透射率增加。

由圖1可以看出，CaCl2對PPI納米粒子溶液透射率的影響大于NaCl，這主要是由于二價的Ca2+于蛋白質的交聯及其靜電屏蔽的作用大于一價的Na+。

圖1 離子強度對PPI納米粒子溶液透射率的影響Fig. 1 Transmittance of PPI nanoparticles with different salt concentrations

2.2 離子強度對PPI納米粒子電位的影響

從圖2可以看出，方PPI納米粒子溶液中加入NaCl和CaCl2都會使其電位發生明顯的降低，且當CaCl2濃度為50 mmol/L和100 mmol/L時PPI納米粒子溶液的電位由-24.82 mV降為-0.56、0.58 mV，隨著CaCl2濃度的進一步增加，PPI溶液表面帶電量反而又增加，且電荷轉化為正電荷。同樣，方PPI納米粒子溶液中加入NaCl后也會使PPI納米粒子溶液表面的電位由-24.82 mV降至為-14.06、-10.12、-7.12、-6.31、-3.71 mV，但與添加CaCl2相比較，即使添加高濃度的NaCl也不會使PPI溶液表面所帶的負電荷轉化為正電荷，這與PPI溶液對NaCl具有很強的耐鹽性有關。

PPI納米粒子溶液添加NaCl和CaCl2引起表面電荷量降低，主要原因為鹽離子的加入一方面會產生靜電屏蔽效應，另一方面鹽離子會與蛋白質發生離子交聯，從而使蛋白質表面的帶電量降低。當CaCl2添加量為500、1 000 mmol/L時，PPI表面所帶的電荷轉變為正電荷可能是由于較高的離子濃度使蛋白質和水分子的結構發生變化導致的[25,27]。

圖2 離子強度對PPI納米粒子溶液電位的影響Fig. 2 Zeta potential of PPI nanoparticles with different salt concentrations

2.3 離子強度對Pickering乳液粒徑的影響

圖3 離子強度對PPI納米粒子穩定的Pickering乳液粒徑大小的影響Fig. 3 Particle size of emulsions stabilized by PPI nanoparticles at different salt concentrations

不同鹽離子對PPI納米粒子穩定的Pickering乳液粒徑大小及其分布如圖3和圖4所示。添加0、50、100、300、500、1 000 mmol/L的NaCl時，形成乳液的粒徑分別為7.86、8.19、9.04、10.85、9.28、13.59 μm（圖3A）。乳液的粒徑分布（圖4A）與其粒徑值結果相對應，從分布圖中可以看出加入NaCl可以使乳液粒徑分布圖的峰寬減小，峰強變強。這主要是由于PPI是鹽溶性蛋白，加入NaCl后產生靜電屏蔽效應，從而使其疏水性增加但不會發生明顯的聚集，所以使乳液粒徑分布更加均勻。特別是當NaCl添加量為1 000 mmol/L時，PPI納米粒子穩定的乳液的粒徑有明顯的增加但粒徑分布峰還是一個單峰，說明高鹽離子的加入使乳液發生了一定程度的聚集使其粒徑增加但未形成沉淀，同時也表明PPI這種鹽溶性的蛋白具有高耐鹽性，可用于一些高鹽性食品的應用。

添加0、50、100、300、500、1 000 mmol/L的CaCl2時，形成乳液的粒徑分別為7.86、24.85、21.49、13.97、11.66、15.32 μm（圖3B）。隨著CaCl2的加入，乳液的粒徑顯著增加，這主要是由于Ca2+的靜電屏蔽和離子交聯的作用使蛋白質的溶解度降低，界面吸附的蛋白減少，乳化性降低，乳液粒徑增加。當CaCl2濃度大于100 mmol/L時，隨著CaCl2濃度的進一步增加，PPI納米粒子穩定的乳液粒徑反而減小，主要是由于高離子強度對PPI及水分子構象的影響使蛋白質的溶解度增加，界面吸附蛋白和乳化性增加，乳液粒徑減小。乳液粒徑分布結果（圖4B）與上述結果一致。

圖4 離子強度對PPI納米粒子穩定的Pickering乳液粒徑分布的影響Fig. 4 Particle size distribution of emulsions stabilized by PPI nanoparticles at different salt concentrations

2.4 離子強度對Pickering乳液貯藏穩定性的影響

圖5 不同NaCl濃度條件下PPI納米粒子穩定的Pickering乳液粒徑大小隨貯藏時間的變化Fig. 5 Particle size of emulsions stabilized by PPI nanoparticles at different NaCl concentrations after storage for up to 28 days

如圖5、6所示，PPI納米粒子穩定的乳液在放置28 d后粒徑沒有明顯的變化。這表明隨著貯藏時間的延長，加入NaCl的乳液具有良好的乳化穩定性，并不會引起乳液液滴之間的不穩定絮凝和奧氏熟化等。

圖6 不同NaCl濃度條件下PPI納米粒子穩定的Pickering乳液粒徑分布隨貯藏時間的變化Fig. 6 Particle size distribution of emulsions stabilized by PPI nanoparticles at different NaCl concentrations after storage for up to 28 days

從圖7可以看出，隨著NaCl濃度的增加，形成的乳液液滴聚集程度逐漸加深，特別是當NaCl濃度為300 mmol/L時，隨著NaCl濃度的進一步增加，乳液的聚集程度反而減小。此外，從圖7還可以看出，由于鹽離子的加入使乳液發生了聚集，但未形成大的液滴。通過觀察不同貯藏時間（1、3、7、14、28 d）乳液液滴的微觀結構，可以看出添加和未添加NaCl的PPI納米粒子穩定的Pickering乳液的微觀結構都沒有明顯變化，這與之前測定的乳液粒徑結果相對應。研究結果表明NaCl的加入不會顯著影響PPI納米粒子穩定的Pickering乳液液滴的粒徑及微觀結構，產生這種現象的原因主要有兩個：1）由于乳液的界面吸附蛋白膜厚度的增加使乳液液滴之間不易發生不穩定性聚集；2）由于PPI是鹽溶性蛋白，因此不會由于鹽離子的加入使蛋白質的溶解度顯著性的降低而影響蛋白質的乳化活性和乳化穩定性。

圖7 不同NaCl濃度條件下PPI納米粒子穩定的Pickering乳液隨貯藏時間變化的微觀結構分布圖Fig. 7 Microphotos of emulsions stabilized by PPI nanoparticles at different NaCl concentrations after storage for up to 28 days

圖8 不同CaCl2濃度條件下PPI納米粒子穩定的Pickering乳液粒徑隨貯藏時間的變化Fig. 8 Particle size of emulsions stabilized by PPI nanoparticles at different CaCl2 concentrations after storage for up to 28 days

如圖8、9所示，隨著CaCl2的添加使乳液的粒徑明顯增加，特別是當CaCl2濃度為50 mmol/L時粒徑最大，隨著Ca2+濃度的進一步增加乳液的粒徑又相對減小，但所有的乳液在貯藏28 d內粒徑沒有明顯變化。從Pickering乳液的微觀結構圖（圖10）也可以看出，CaCl2濃度為50 mmol/L和100 mmol/L時形成的乳液液滴粒徑最大，當CaCl2濃度為300、500 mmol/L和1 000 mmol/L時乳液的粒徑又減小，而且添加CaCl2的乳液相對于未添加CaCl2的乳液液滴聚集程度增加。產生這種現象主要是因為Ca2+靜電屏蔽效應及與蛋白質及氨基酸的交聯作用，使蛋白質不能有效吸附到油水界面從而降低了蛋白質的乳化容量[28-29]，乳液粒徑增加；而高濃度的Ca2+會改變水分子及蛋白質的構象從而使蛋白質的乳化性能提高，粒徑減小[30-31]。同時，由于PPI納米粒子表面電荷的變化，使形成的乳液發生聚集。

圖9 不同CaCl2濃度條件下PPI納米粒子穩定的Pickering乳液粒徑分布隨貯藏時間的變化Fig. 9 Particle size distribution of emulsions stabilized by PPI nanoparticles at different CaCl2 concentrations after storage for up to 28 days

圖10 不同CaCl2濃度條件下PPI納米粒子穩定的Pickering乳液隨貯藏時間變化的微觀結構分布圖Fig. 10 Microphotos of emulsions stabilized by PPI nanoparticles at different CaCl2 concentrations after storage for up to 28 days

2.5 離子強度對Pickering乳液流變性質的影響

圖11 不同離子強度條件下PPI納米粒子穩定的Pickering乳液穩態掃描Fig. 11 Steady state fl ow curves of emulsions stabilized by PPI nanoparticles at different salt concentrations

從圖11可以看出，添加NaCl和CaCl2的乳液的表觀黏度都隨著剪切速率的增加而降低，即所有乳液都表現出非牛頓流體剪切變稀的現象。其中，在低剪切速率時加入鹽離子的乳液表觀黏度都明顯高于未添加鹽離子的乳液，隨著剪切速率的增加乳液的黏度明顯減小，這證明鹽離子的加入使乳液液滴之間的相互作用增強，聚集程度加深[25,32]。

添加CaCl2引起乳液表觀黏度的增加遠大于添加NaCl，這主要是由于Ca2+可與蛋白質及氨基酸的羧基發生離子交聯，從而使乳液的表觀黏度增加大于一價的Na+。此外，Ca2+還會形成網狀結構，提高乳液的穩定性及乳液的黏度。從圖11可以看出，當CaCl2濃度為50 mmol/L和100 mmol/L時，乳液的初始表觀黏度值最高分別為25.29 Pa?s和25.84 Pa?s，這與PPI的溶解度及界面吸附蛋白膜的厚度相關。

3 結 論

綜合上述研究結果，可以得出以下結論：添加低濃度的NaCl或CaCl2會使PPI納米粒子溶液的電位和溶解度降低，但隨著鹽離子濃度進一步增加，蛋白質的結構和水分子的構象發生改變，使其溶解度又升高。此外，添加不同濃度的NaCl或CaCl2時都會使乳液的粒徑增加，粒徑分布峰寬變窄，峰強變強，黏度增加且都具有良好的貯藏穩定性。其中，Ca2+的加入對乳液的粒徑影響大于Na+，表明PPI納米粒子制備的Pickering乳液具有更好的耐NaCl特性。