啤酒釀造中二甲基硫、甲基蛋氨酸、二甲基亞砜含量的變化與控制

劉 成，杜金華*，鮑 姣

（1.山東農業大學食品科學與工程學院，山東 泰發 271018；2.山東泰山啤酒有限公司，山東 泰發 271000）

二甲基硫（dimethyl sulfide，DMS），又名二甲基硫醚，在自然界中普遍存在，是最重要的揮發性硫化物，它是海洋溫度高低自動調節的重要物質。DMS是GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》[1]中規定的允許使用的食用香料，主要用于配制玉米、番茄、土豆、奶制品、菠蘿和橘子類果香及青香型香精。適度的DMS含量對啤酒風味有益，但過量會對啤酒風味產生不良影響。DMS在水中的閾值為30 μg/L，不同啤酒中的閾值會因啤酒種類不同也有所不同，大多釀酒師認為閾值為30～60 μg/L[2-3]。控制啤酒中DMS質量濃度在60 μg/L以下被國際釀酒師所接受[4-5]，過量的DMS會導致啤酒有一種“生酒味”、“菜味”、“煮玉米味”、“甜麥芽味”或者“黑醋栗芽苞”的味道[6]。另外DMS有一定毒性，低濃度的DMS會引起頭痛、惡心和嘔吐，高濃度DMS會對中樞神經系統有麻痹作用。

上世紀80年代，國外對啤酒中DMS展開研究，結果表明啤酒中的DMS有兩個重要來源：1）大麥胚萌發過程中產生的甲基蛋氨酸（S-methylmethionine，SMM）熱分解所得；2）酵母還原二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）得到DMS[3,7-9]。第1個途徑主要發生在麥芽焙焦過程與麥汁煮沸過程中，第2個途徑主要發生在發酵過程中。將SMM與DMSO統稱為二甲基硫前驅體（dimethyl sulfide precursor，DMSP）。根據DMS的產生源頭，控制啤酒中DMS含量主要通過兩個途徑[10]：1）通過選擇低DMS前驅物含量的麥芽種類，控制煮沸時間、麥汁pH值與煮沸后高溫等待時間調控SMM方DMS的轉化；2）優選酵母菌株、調整麥汁濃度、氨基氮含量以及發酵罐類型、發酵溫度調控DMSO還原為DMS的含量。

國內學者對啤酒中DMS含量的影響因素也進行了相應研究。溫科[11]研究發現在制麥過程中添加赤霉素和溴酸鉀可對DMS及DMSP表現出不同的抑制作用。王芝梅[12]研究表明國產大麥的SMM含量高于Cervoise大麥，制麥過程中發芽及干燥初期麥粒中的SMM含量處于增長的趨勢。房慧婧等[13]對糖化煮沸及沉淀過程中DMS、SMM含量進行了研究，結果表明麥汁中的游離DMS在煮沸過程可降至最低，但澄清、冷卻階段又重新升高，SMM含量在麥汁制備過程中一直呈下降趨勢。王德良等[14]研究了發酵過程中發酵液的DMS含量的影響因素，發酵溫度、酵母代數、有害微生物對發酵液DMS含量有顯著影響。

在國外，Sinclair等[15]和Bamforth[16]證明全麥芽的Lager啤酒中DMS含量高于Ale啤酒。這是由于Ale啤酒的麥芽焙焦溫度比Lager啤酒的麥芽焙焦溫度高，SMM熱分解更為徹底[10]。但國內學者唐朝艷[17]抽取市場5 個啤酒樣品，DMS質量濃度在21～29 μg/L，含量均低于閾值。國內市場大多的Lager啤酒由于添加了大米、糖漿、淀粉等輔料，反而使得Lager啤酒中的DMS含量大多在閾值以下。然而近年來，由于國內的消費升級，全麥芽的特色啤酒越來越受歡迎，啤酒使用全麥芽作為原料后容易導致DMS含量升高，甚至超出風味閾值，因此DMS含量變成了國內釀酒師釀造全麥啤酒時越來越受重視的一個重要風味指標。

本研究抽取國內15 個商品啤酒樣品，對其DMS含量進行檢測分析，對釀造過程中麥芽、麥汁、發酵液的DMS、SMM、DMSO含量變化過程進行詳細研究，同時對啤酒生產過程中的DMS含量控制方法進行探討。本實驗對研究全麥啤酒釀造過程中DMS含量的上升原因、控制成品啤酒的DMS含量有參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

偏重亞硫酸鈉（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；甲基乙基硫醚（＞96.0%）、DMS（＞99.7%）阿拉丁試劑有限公司；麥芽為隨機抽取市售10 種樣品，啤酒為隨機抽取市售15 種啤酒樣品。

1.2 儀器與設備

Clarus 500 GC氣相色譜儀 美國PerkinElmer公司；DMA4500全自動啤酒分析儀 奧地利發東帕商貿有限公司；LXJ-IIB飛鴿離心機 上海發亭科學儀器廠；Buhler DLFU麥芽研磨機 麥科儀（北京）科技有限公司；Stomboil煮沸鍋 德國克朗斯股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

麥芽處理參照Baldus[18]與Yang[19]等的方法。稱取20.00 g麥芽（麥芽于4 ℃冰箱預冷12 h）于研磨機研磨得到麥芽粉于密封袋暫存。稱取10.00 g研磨好的麥芽粉轉移至250 mL碘量瓶，加入100 mL蒸餾水搖勻，室溫下振蕩搖勻35 min后轉移至離心管（氮氣排空10 s）中，50 000 r/min離心5 min，上清液加蓋濾紙快速過濾，濾液用于樣品檢測。

麥汁取樣后立即密封冷卻至4 ℃，用單層濾紙加蓋快速過濾后用于樣品檢測。啤酒樣品冷卻至4 ℃后直接進行檢測。

1.3.2 麥汁煮沸

麥汁煮沸在帶內加熱器的Stom boil煮沸鍋內完成，煮沸過程中不同時間麥汁溫度、蒸汽耗用數據見表1。

表1 煮沸過程溫度、蒸汽壓力及蒸汽耗用數據Table 1 Temperature, steam pressure and steam consumption during the boiling process

1.3.3 DMS、SMM、DMSO的氣相色譜-氫火焰離子化檢測

DMS、SMM檢測參考ASBC分析方法《頂空氣相色譜法測定二甲基硫前體物質含量》[20]。DMSO檢測參考Baldus分析方法[18,21]，氮吹清除游離DMS。

色譜柱：DB-WAX（0.53 mm×30 m，1.0 μm）；升溫程序：37 ℃保持2.3 min，以10 ℃/min升至60 ℃，20 ℃/min升至120 ℃，30 ℃/min升至220 ℃，保持1 min；氫火焰離子化檢測器，溫度230 ℃，載氣N2，流速8 mL/min，進樣時間0.05 min。

1.3.4 三角瓶發酵實驗

發酵實驗在2 L三角瓶內進行，麥汁麥芽配比為60%大麥芽與40%小麥芽，麥汁濃度為10.2 °P，麥汁量為1 L，上面酵母接種，接種量為2×106CFU/mL，發酵溫度為25 ℃，常壓發酵。

1.3.5 大罐發酵實驗

接種麥汁麥芽配比為60%大麥芽與40%小麥芽，麥汁濃度為12.2 °P，滿罐麥汁總量400 m3，上面酵母接種，接種量為2×106CFU/mL。

1.4 數據分析

所有實驗均重復3 次，用SPSS Statistics 22.0、Excel 2010統計分析數據并制圖。

2 結果與分析

2.1 15 種市售啤酒的DMS含量

表2 市售啤酒樣品的DMS含量Table 2 DMS contents of commercial beer samples

抽取國內15 個啤酒樣品進行DMS含量檢測，結果見表2。由結果得知，不同樣品DMS含量差別較大，波動范圍為20～105 μg/kg，與Liu Chunfeng等[22]檢測14 種國內啤酒樣品DMS含量結果49～102 μg/kg相近，同時Liu Chunfeng等[22]研究還得出國內DMS含量較低的啤酒更受歡迎的結論。本實驗中15 個樣品中有7 個樣品超出閾值（60 μg/kg），品評部分有生青味，占總體抽檢樣品比例的47%，運用SPSS對數據進行相關性分析，結果表明啤酒DMS含量與啤酒類型之間呈顯著相關性，相關系數0.538（P＜0.05），其中Lager啤酒中有25%超出閾值，Ale啤酒中有71%超出閾值。因此DMS含量應該是國內釀酒師關注的指標，特別是生產全麥芽的Ale啤酒。抽檢樣品中，8 個Lager啤酒樣品DMS平均含量為46 μg/kg，7 個Ale啤酒樣品DMS平均含量為72 μg/kg，Ale啤酒的DMS含量高于Lager啤酒，這與國外檢測結果相反。國外檢測Lager啤酒DMS含量高于Ale啤酒，其原因是在麥芽焙焦過程中，溫度升高，SMM的總量減少，Ale啤酒麥芽的焙焦溫度比Lager啤酒的麥芽焙焦溫度高，SMM熱分解更為徹底，麥汁中產生的DMS含量低于Ale啤酒，同時Ale啤酒一般采用高溫發酵，導致最終Ale啤酒DMS含量低于Lager啤酒[10]。而在國內Lager啤酒麥汁原濃大多比Ale啤酒原濃低，且多數Ale啤酒使用全麥芽作為原料，未添加糖漿大米等輔料或添加比例較低。White[23]與孫軍勇[24]等檢測國內大米、糖漿輔料中不含有或含有極少量的DMS及DMSP，從而降低了成品Lager啤酒中DMS的含量，因此檢測國內樣品中Ale啤酒的DMS含量高于Lager啤酒。

2.2 市售麥芽DMS、SMM、DMSO含量

表3 市售不同麥芽樣品的DMS、SMM、DMSO檢測結果Table 3 DMS, SMM and DMSO contents of malts μg/g

抽取國內市場4 個廠家6 種澳麥芽品種、4 種國產小麥芽，檢測DMS、SMM、DMSO含量。從表3中可以看出，澳麥芽DMS含量在1.55～4.03 μg/g范圍內波動，這與Dickknson[25]測定的英國Lager麥芽與White等[26]測定的英國Julia Lager麥芽含量范圍相符，但溫科[11]制麥過程中的檢測數據差別較大，與唐朝艷[17]的檢測結果（0.15～1.36 μg/g）相近。Dickknson[25]測定的英國Lager麥芽DMS與SMM含量高于Ale麥芽，而DMSO含量Lager麥芽低于Ale麥芽，這與麥芽的焙焦溫度、含氮量有關[10,19,27]。實驗中6 個澳麥芽之間DMS含量波動較大，澳麥芽5是澳麥芽2的2.6 倍，澳麥芽6的SMM含量也達到澳麥芽2的2.09 倍。運用SPSS對數據進行相關性分析，結果表明麥芽SMM含量及DMSO含量與麥芽類型之間呈顯著相關性，相關系數分別為0.420（P＜0.01）、0.831（P＜0.01）。而啤酒中的DMS含量主要受麥芽中SMM與DMSO含量影響較大[24]，因此同一生產工藝選用不同品種麥芽可造成定型麥汁DMS含量偏差較大，釀酒師在糖化生產前需特別關注大麥芽中的DMSO與SMM含量，根據含量不同調整糖化的生產工藝。美國、加拿大部分啤酒廠也已經把麥芽中DMS相關指標納入標準，成品麥芽總DMS含量小于2 μg/g。除小麥芽4外其余麥芽DMS、SMM、DMSO含量均比澳麥芽含量低，所以選用合適的小麥芽品種、適當提高小麥配比可以降低定型麥汁的DMS含量。

2.3 煮沸時間對DMS、SMM、DMSO影響

圖1 煮沸時間對麥汁DMS與SMM含量影響Fig. 1 Effect of boiling time on the contents of DMS and SMM in wort

圖2 麥汁煮沸前后DMSO含量對比Fig. 2 Comparison of DMSO content of wort before and after boiling

研究10.2 °P麥汁在Stormboil煮沸鍋中煮沸過程的DMS及SMM含量變化，如圖1所示。煮沸的初始麥汁量為104.3 t，結束麥汁量為99.9 t，煮沸強度為4.2%，煮沸過程中未添加任何水，煮沸過程麥汁pH值控制在5.6，煮沸結束時調整pH值至5.5左右。從圖1可以看出，DMS在前40 min內有一個快速的降低過程，40 min時達到30 μg/kg，降低92%，隨后的20 min內降低速度減緩，整個過程中DMS降低速率遠高于麥汁蒸發率，因為麥汁蒸發對DMS與SMM含量升高的影響可以忽略。DMS降低主要是因為DMS沸點只有38 ℃，在100 ℃高溫情況下會快速蒸發，再加上Stormboil采用強制循環、增加麥汁揮發面積的煮沸方式，能夠保證DMS的揮發速度大于SMM分解速度，從而起到快速降低麥汁中DMS的含量。

根據Scheuren等[3]的研究，SMM熱分解符合提出的一級動力學反應Ct＝C0e-kt，Ct為SMM隨時間變化的瞬時濃度，C0為初始濃度，參數k描述了與溫度有關的反應速度。半衰期時間還與實際生產過程中麥汁煮沸時的壓力有關[26-28]，實驗在Stormboil煮沸鍋中進行，煮沸過程中鍋內壓力為1 個大氣壓。運用Excel對圖1中SMM含量在0～60 min內分解曲線進行模擬，趨勢線指數函數為Ct=440.07e-0.023t（R2=0.990 7），此模型中模擬了SMM濃度與加熱時間的關系，與Scheuren等[3]的一級動力學反應相符，由此可以計算SMM在100 ℃、pH 5.6時半衰期為31 min，與Dickenson[29]研究SMM在98.5 ℃的半衰期為30.5 min相符。

圖2中DMSO含量煮沸開始至煮沸60 min結束增加了83%，說明煮沸過程中部分從DMS被氧化為DMSO。

2.4 麥汁沉淀過程DMS、SMM、DMSO含量變化

圖3 麥汁煮沸結束至過料結束不同時間下DMS與SMM含量變化Fig. 3 Trends of DMS and SMM contents in boiled wort during precipitation

如圖3所示，隨著在高溫區保留時間延長，SMM不斷減少，DMS含量不斷增加。煮沸結束至過料結束，麥汁溫度始終保持在98 ℃以上，SMM在高于70 ℃溫度下會繼續熱分解產生DMS[30]，而沉淀槽中的麥汁揮發面積較小，DMS被保留在麥汁中，導致DMS含量繼續上升。SMM含量從煮沸結束至過料結束降低54 μg/kg，DMS增加量為40 μg/kg，74%的熱分解產生的DMS被麥汁溶解。

圖4 麥汁煮沸結束與沉淀結束DMSO含量對比Fig. 4 Comparison of DMSO content of wort after boiling and precipitation

如圖4所示，在沉淀槽內停留40 min后DMSO只有小幅增加，總含量只增加了5%，沉淀過程中DMS少量被氧化。

2.5 三角瓶發酵過程DMS、SMM、DMSO含量變化

實驗室內用高SMM含量的麥汁作為接種麥汁，添加上面酵母在三角瓶內進行常壓發酵，研究酵母發酵過程的DMS、SMM、DMSO含量，結果如圖5所示。在常壓下啤酒中的DMS隨發酵產生的CO2散失，而SMM被酵母作為氮源消耗，但是未見發酵液中DMS有明顯上升，這由于SMM被酵母代謝而未產生活性DMS，這與Scheuren等[8]描述相符。DMSO含量在發酵第3天時有明顯的上升趨勢，這可能與DMS被氧化有關。文獻[19,31]報道DMSO是啤酒中DMS的重要前驅物，Sugai等[32]研究發現在Lager酵母與Ale酵母中均能產生蛋氨酸亞砜還原酶，將DMSO還原為游離DMS，但兩種酶的活性差別較大，不同的酵母菌株有不同的還原能力，而且酵母可利用氮源較少時DMSO被還原的量增多，發酵溫度低比發酵溫度高時酵母還原DMSO的量多[33-35]。實驗中該酵母菌株未能將麥汁中的DMSO大量還原，這與實驗用酵母菌種、麥汁氨基氮含量較高、上面發酵溫度有關。

圖5 三角瓶發酵過程DMS、SMM、DMSO含量變化Fig. 5 Trends of DMS, SMM and DMSO contents during fermentation

2.6 400 t發酵罐發酵過程DMS、SMM、DMSO含量變化

圖6 400 t發酵罐發酵過程DMS含量與糖度變化Fig. 6 Trends of DMS content and gravity during fermentation in 400-t fermenter

如圖6所示，1～2 d為麥汁滿罐過程，前2 d滿罐后DMS含量有上升趨勢，2 d時達到最高值，為73 μg/kg。2 d后酵母進入厭氧發酵，糖度由11.6 °P快速降低為7.7 °P，發酵進入旺盛期，DMS隨著CO2產生而揮發，下降速度較快，3 d時達到DMS最低值為43 μg/kg，為最高值的59%。Hansen等[35-36]報道61%～72%麥汁DMS都被發酵過程中的CO2洗滌排出罐外。3～7.5 d后隨著糖度下降速度降低而趨于穩定。7.5 d后開始降溫后貯，發酵后貯過程中DMS含量有升高趨勢，啤酒降溫后DMS溶解增高。釀酒師為了控制啤酒DMS含量，可以在發酵過程中適當推遲封罐時間，讓DMS隨之CO2而排出。

圖7 400 t發酵罐發酵過程SMM、DMSO含量變化Fig. 7 Trends of DMSO and SMM contents during fermentation in 400-t fermenter

如圖7所示，SMM含量在發酵初期有明顯的下降趨勢，這與本實驗室得出的結論相符，部分硫甲基蛋氨酸被酵母代謝消耗，較峰值降低65%左右。DMSO含量前3 d穩定，這于Baldus等[7]研究相符，發酵期間前3 d DMSO含量穩定，3 d后少量的DMSO被還原為DMS，Baldus等[7]研究中第7天時6%的DMSO被還原，而這種還原受到限制，由于麥汁中存在著高濃度的蛋氨酸氧化硫，它是DMSO還原的強烈抑制劑。本實驗3 d后觀察到DMSO含量有升高趨勢，其原因需要進一步驗證。

3 結 論

DMS是啤酒中的重要風味指標，但GB 4927—2008《啤酒》[37]中未進行強制要求。本研究檢測國內市場上常見的15 種啤酒樣品的DMS含量，其中47%的抽檢樣品DMS含量超出60 μg/kg，因此DMS應該是國內釀酒師重點關注的指標，特別是國內全麥芽的Ale啤酒。

實驗對國內市場10 個麥芽樣品的DMS及DMSP進行檢測，不同麥芽間DMS與DMSP差異較大，多數小麥芽的DMS與DMSP含量較澳麥芽低，因此釀酒師選用合適的小麥芽品種、適當提高小麥配比利于降低啤酒中的DMS含量。實驗研究了麥汁煮沸及沉淀過程中的DMS及DMSP含量的變化，麥汁在100 ℃、pH 5.6時，煮沸0～40 min階段DMS含量降低較快，40 min時達到30 μg/kg，SMM的半衰期為31 min，SMM分解動力學和DMS的揮發性可以用來計算和預測麥汁中DMS含量，是優化麥汁生產的有效工具，這給啤酒釀造師制定糖化工藝提供了理論依據。研究發酵過程中的DMS及DMSP含量變化，結果表明DMS在發酵旺盛期時有明顯的下降趨勢，麥汁中65%的SMM被酵母利用，釀酒師在控制DMS含量時可考慮適當延長發酵封罐時間，使更多的DMS排出罐外。