固相萃取聯合超高效液相色譜-串聯質譜法測定畜肉中3 種兒茶酚胺類物質

任 南，趙文濤，陳 超*，吳彥超，張穎穎，李瑩瑩，郭文萍，范 維，王守偉

（中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

兒茶酚胺類是一種含有兒茶酚和胺基的物質，化學結構特點為都有一個雙羥基苯核和一個帶氨基的側鏈[1-2]。腎上腺素、去甲腎上腺素、異丙腎上腺素、腎上腺酮、多巴胺及相關衍生物均屬于兒茶酚胺類[3-5]。兒茶酚胺類是體內重要的神經遞質，與多種生理、病理現象密切相關，在機體維持內穩態平衡過程中起著關鍵的作用[6-9]。兒茶酚胺類物質互相之間有著緊密的聯系，受多種因素調節[10-12]。自20世紀60年代，腎上腺素類藥物一直被認為是增加恢復心跳機會的特效藥[13]，腎上腺素類藥物讓人產生巨大的爆發力，為常用急救藥物，但過量則可引起中毒，不良反應包括頭痛、焦慮不發、煩躁、面色蒼白、眩暈、多汗、心跳異常增快等，嚴重者引發胸痛和心律失常，甚至死亡[14-16]；早在1963年，有學者發現，通過使用如咖啡因和腎上腺素等β受體激動類物質，可以促進動物的生長。此后越來越多的β受體激動劑（瘦肉精）被研發出來，后因殘留對人體產生危害而被禁止[17-19]。

近年來，注水肉問題受到越來越多的消費者及監管部門的關注。不法分子為了謀取暴利，將兒茶酚胺類藥物和水一同注入生豬體內，生豬服用兒茶酚胺類藥物后口渴感增強，提高注水量，宰殺后不僅增重而且豬肉顏色鮮紅，易于出售[20]。導致近幾年注水肉屢禁不止的主要原因是注水肉的關鍵判定指標不明確，注水肉的生物屬性或理化屬性研究滯后[21]。我國對豬肉中兒茶酚胺類藥物的檢測方法鮮見報道，因此研究豬肉中兒茶酚胺類藥物的檢測方法迫在眉睫，檢測方法的建立不僅為探索注水肉的關鍵指標提供依據，而且為監管部門打擊違法行為提供有力手段。

20世紀40年代便有學者對兒茶酚胺進行分析研究，測定方法主要是乙二胺縮合法和三羥基吲哚法[22]。隨著新技術的發展，產生了多種測定方法，如化學發光法、熒光光譜法、電化學法、免疫分析法、質譜法以及各種色譜法和多種方法聯用等[23-30]。兒茶酚胺的研究多集中于血漿、尿液樣本的檢測[31-33]，肉類樣品基質復雜，兒茶酚胺類物質易受到樣品的干擾[3]，因此如何排除樣品的干擾，是畜肉中兒茶酚胺類物質測定的難點。目前兒茶酚胺類物質多用高效液相色譜-電化學法檢測，但存在樣品前處理時間長、檢測時間長、存在干擾等問題[34]，而且大多針對體液樣品。隨著分析技術的不斷進步，固相萃取聯合液相色譜-串聯質譜法應運而生，固相萃取技術是利用選擇性吸附和選擇性洗脫的液相色譜分離原理，以達到快速分離、提取、富集目標化合物的一種預處理技術。固相萃取技術具有簡便、快速、精確、使用溶劑少、回回率高、易于和其他儀器聯合使用等優點被廣泛應用于多個領域[35]。液相色譜-串聯質譜具有檢測時間短、樣本用量小、靈敏度和特異性高的優點[36]。因此選用固相萃取與液相色譜-串聯質譜法，旨在建立一種檢測畜肉中兒茶酚胺類藥物的靈敏和特異性的方法，并對方法的可靠性進行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腎上腺素（純度99.4%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司；去甲腎上腺素（純度98%） 上海阿拉丁公司；異丙腎上腺素標準品（純度99.0%），乙腈、甲醇（均為色譜純） 上海發譜實驗科技股份有限公司；高氯酸（優級純）、氨水（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；水無特殊說明均為一級水。

1.2 儀器與設備

1290超高效液相色譜儀、6470三重四極桿串聯質譜儀 美國Agilent公司；CR21N離心機 日本Hitachi公司；S-100渦旋儀、SR-IIw振蕩器 日本Taiyo公司；ABM-2均質機 株式會社日本精機制作所；Milli-Q純水儀 美國Millipore公司；Cleanert PCX固相萃取柱博納艾杰爾公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

標準儲備溶液：準確稱取10 mg固體標準品，置于100 mL燒杯中，加適量0.4 mol/L高氯酸溶解，并用0.4 mol/L高氯酸溶液轉移并定容至100 mL容量瓶中，搖勻，配制成質量濃度為100 mg/L標準儲備液，4 ℃以下冰箱中避光保存。

混合標準溶液：吸取各標準儲備溶液適量，用一級水配制成混合標準溶液。

1.3.2 樣品提取與凈化

提取：稱取試樣2 g（精確至0.001 g）于100 mL離心管中，加入10 mL 0.4 mol/L高氯酸溶液，15 000 r/min均質2 min，再用10 mL 0.4mol/L高氯酸溶液清洗刀頭，12 000 r/min離心15 min，上清液轉移至另外一離心管中，殘渣再加入10 mL 0.4 mol/L高氯酸溶液，15 000 r/min勻漿2 min進行2 次提取，12 000 r/min離心10 min合并2 次提取溶液，待凈化。

凈化：Cleanert PCX柱使用前依次用5 mL甲醇、5 mL水、5 mL 0.1 mol/L高氯酸溶液活化，取提取液10 mL至Cleanert PCX柱，以1 mL/min通過PCX小柱后，分別用5 mL 0.1 mol/L高氯酸、5 mL一級水淋洗，最后用5 mL氨水-甲醇溶液（5∶95，V/V）洗脫，回集洗脫液于試管中，40 ℃氮吹近干，用甲酸-水（1∶99，V/V）溶液定容1 mL，渦旋混合1 min，過0.22 μm濾膜后測定。

1.3.3 儀器條件

色譜條件：HILIC Plus色譜柱（4.6 mm×100 mm，3.5 μm）；流速0.4 mL/min；流動相A為甲酸-水（1∶99，V/V）；流動相B為乙腈；柱溫30 ℃；進樣量5 μL。洗脫條件見表1。

表1 洗脫條件Table 1 Gradient elution program

質譜條件：電噴霧離子源，正離子模式；干燥氣溫度300 ℃；毛細管電壓3 000 V；噴霧器壓力35 psi；干燥氣流速8 L/min；鞘氣流速11 L/min；鞘氣溫度400 ℃。質譜參數見表2。

表2 3 種兒茶酚胺類物質的質譜參數Table 2 MS parameters for 3 CAs

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

圖1 目標化合物結構式Fig. 1 Molecule structures of 3 CAs

如圖1所示，3 種化合物均為含氨基的弱堿性化合物，易帶正電荷，在正模式掃描下響應值較高，采用選擇離子掃描選定化合物母離子，同時優化毛細管出口電壓以保證化合物的母離子豐度，選定母離子后再進行子離子掃描，優化碰撞能量確定3 種化合物的子離子（表2）。

3 種化合物結構相似，都帶有3 個羥基，均為極性化合物，在非極性色譜柱上保留較弱，為使化合物更好分離和得到良好峰形，本實驗選擇HILIC親水色譜柱進行分析，同時在流動相中加入少量甲酸提高樣品的離子化效率，以增大化合物響應值，所以本方法選擇乙腈與0.1%甲酸-水（1∶99，V/V）作為流動相，結果見圖2。

圖2 3 種化合物樣品空白及樣品添加多反應監測圖Fig. 2 MRM chromatograms of three CAs in negative and positive samples

2.2 提取溶劑的選擇

3 種兒茶酚胺類化合物均含有羥基和氨基，易溶于水溶液和有機溶劑，但由于3 種兒茶酚胺類藥物易被氧化，所以在提取溶液中加入適量酸以防止氧化，本實驗對比酸化甲醇、酸化乙腈、0.4 mol/L高氯酸溶液、磷酸鹽緩沖溶液（pH 4.0）作提取溶劑，加標量為100 μg/kg時的回回率，如圖3所示。0.4 mol/L高氯酸溶液作提取溶劑時，3 種兒茶酚胺類均有較高回回率，平均回回率可達80%以上，故選取0.4 mol/L高氯酸溶液作為提取溶劑。

圖3 不同提取溶劑回收率對比Fig. 3 Effect of extraction solvents on the recoveries

2.3 提取方式的選擇

圖4 不同提取方式回收率對比Fig. 4 Effect of extraction methods on the recoveries (n = 3)

肉類由于其脂肪、蛋白含量比較高，某些基質會對樣品提取的過程造成影響[37]，因此考察常見4 種提取方式，結果見圖4。勻漿不僅誤差較小而且提取效率可達到85%以上，因此選用勻漿為提取方法。

2.4 固相萃取柱的選擇

圖5 不同固相萃取柱回收率對比Fig. 5 Effect of SPE columns on the recoveries

考察HLB柱、PCX柱、SCX柱、堿性氧化鋁柱對目標化合物的提取、凈化效果，結果見圖5。固相萃取柱對于3 種目標物質的保留都比較穩定，PCX柱對3 種目標化合物（添加量40 μg/kg）回回率均高于其他固相萃取柱。

從提取溶劑、提取方式、固相萃取柱的選擇看，3 種化合物之間回回率具有相似的規律，這可能是由于它們的結構和化學性質相似。腎上腺素在不同的影響因素中回回率最低，可能是其化學性質與另外2 種相比更不穩定，更容易被外界（基質/環境）因素干擾。不同提取溶劑和不同固相萃取柱對3 種化合物內回回率的誤差差異較小，不同提取方式對3 種化合物內回回率的誤差差異較大，因此提取方式的選擇對方法的穩定性影響較大。

2.5 基質效應評價

基質效應是由基質中的共提干擾物（非目標化合物）與目標化合物競爭電離所致[38]。基質效應會影響檢測結果的準確性，因此需要進行基質效應的評價[39]。實驗選取豬肉、牛肉、羊肉進行基質效應評價，結果見表3，3 種藥物在豬肉、牛肉、羊肉基質中都屬于強基質效應，如果用溶劑配制標準曲線定量，會造成結果有偏差，因此需要選擇基質標準曲線進行定量，以消除基質效應的影響。

表3 3 種藥物的基質效應評價Table 3 Matrix effect evaluation of three CAs

2.6 方法學結果

2.6.1 標準曲線、檢出限與定量限測定結果

用空白基質配制標準溶液，制作標準曲線，質量濃度分別為40、50、100、500、1 000 ng/mL，在選定的前處理和儀器條件下進行測定，得到不同質量濃度的色譜圖，以添加兒茶酚胺類藥物質量濃度為橫坐標，兒茶酚胺類藥物峰面積為縱坐標，得到3 種化合物的線性方程及相關系數。利用逐級稀釋法方空白樣品中添加已知質量濃度的混合標準溶液，以3 倍信噪比確定檢出限，10 倍信噪比確定定量限，結果見表4。該方法在40～1 000 μg/kg范圍內3 種兒茶酚胺類物質的線性良好，相關系數均大于0.99，檢出限為10 μg/kg，定量限為40 μg/kg。

表4 3 種兒茶酚胺類藥物的線性方程、相關系數、檢出限、定量限、線性范圍Table 4 Regression equations, correlation coefficients, LODs, LOQs and linear ranges of three CAs

2.6.2 加標回回率及相對標準偏差測定結果

分別稱取牛肉、豬肉、羊肉空白樣品各18 份，每份2.0 g，每種空白樣中分別添加40、400、1 000 μg/kg 3 個水平的混合標準溶液，每個水平6 個平行樣品，后按1.3.2節和1.3.3節方法制備進行實驗，結果見表5。不同添加水平的3 種兒茶酚胺類物質的回回率在75.48%～91.25%之間，相對標準偏差為1.2%～4.6%，回回率和相對標準偏差均符合日常檢測的要求。

表5 豬肉、牛肉、羊肉中加標回收率及相對標準偏差結果Table 5 Spiked recoveries for three CAs in different matrix samples(n= 6)

2.7 標準溶液穩定性結果

表6 放置不同時間3 種藥物標準溶液的穩定性Table 6 Storage stability of standard solutions of three CAs

將低、中、高，3 個質量濃度的腎上腺素、去甲腎上腺素、異丙腎上腺素標準溶液混標放置于室溫（25 ℃）下，比較同一條件下不同放置時間的標準溶液穩定性差異。如表6所示，3 種藥物在室溫放置12 h較穩定，放置24 h后腎上腺素開始逐漸降解，質量濃度降低至原來的85%，放置36 h后腎上腺素質量濃度降低至原來的80%，去甲腎上腺素和異丙腎上腺素質量濃度降低至原來的90%，所以為了保證結果準確，建議標準溶液臨用現配，同時樣品提取液需在12 h內完成上機檢測。

2.8 實際樣品的測定結果

采用本方法對市售的140 件畜肉進行測定，種類包括牛肉、羊肉、豬肉，1 件豬肉樣品檢出腎上腺素，含量為50 μg/kg。同時對該樣品進行水分測定，結果大于77%，不符合GB 18394—2001《畜禽肉水分限量》的要求，表明兒茶酚胺類物質對水分是否超標具有一定的指示作用。

3 討 論

本實驗采用固相萃取技術與超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定畜肉中腎上腺素、去甲腎上腺素、異丙腎上腺素3 種兒茶酚胺類藥物，方法簡便、快速。方法學評價結果表明，本方法準確、可靠，為考察注水肉的關鍵指標提供思路，為監管部門打擊違法行為提供手段。同時方法還存在一些不足，對于同種影響因素內部誤差產生的差異以及不同化合物間回回率差異的原因仍需進行大量研究工作。兒茶酚胺類化合物大部分是生物體內正常代謝產生的物質，因此如何判定外源性注射兒茶酚胺仍需進一步研究。