高效液相色譜-串聯質譜法檢測動物源性食品中異丙嗪

李志剛，李慧晨，馬燕紅*，王守偉，任 南，郭文萍，郭 超，李瑩瑩

（中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

鹽酸異丙嗪屬于噻吩嗪類抗組胺藥，是一種對中樞神經系統有抑制作用的鎮靜劑，臨床上用于治療精神分裂癥、狂躁癥、抑郁癥、反應性神經病及其他重癥精神病[1]；也可用于鎮吐、抗暈動以及鎮靜催眠[2]、支氣管肺炎、腹瀉、哮喘、食物過敏等癥狀的治療[3]；在動物飼養和運輸過程中使用以降低動物的維持需要和減少途中體質量降低、死亡率[4]。噻吩嗪類的鎮靜劑可造成過敏反應，引起體位性低血壓、心悸、躁動、口干、藥疹等副作用[5]，對人的內分泌、運動和循環等系統以及肝臟器官造成不良影響，引起肝功能障礙、接觸性皮炎和皮疹等毒副作用[6-7]，給人體健康帶來較大風險。因此日本、美國和歐盟等多個國家規定噻吩嗪類鎮靜劑及其代謝物不得在動物源食品中檢出。我國農業部公告第176號、第2583號公告規定鹽酸異丙嗪禁止在飼料和動物飲用水中使用。但一些不法商販利用鹽酸異丙嗪強大的鎮靜、催眠、鎮吐作用，降低動物大量注水后發生過激反應，同時結合其他藥物使用，減緩畜類的疼痛感、增加宰后產品質量，獲取不義之財。

圖1 異丙嗪的結構式Fig. 1 Chemical structure of promethazine

目前鮮見動物源性食品中異丙嗪（結構式如圖1所示）檢測的國家標準，已報道這類鎮定劑化合物的檢測方法主要有紅外光譜法[8]、酶聯免疫法[9]、氣相色譜-質譜法[10-12]、高效液相色譜-紫外法[13-15]、毛細管電泳-電致化學發光法[16]、液相色譜-質譜法[17-23]等。但這些文獻大部分的基質多為人或動物的血液、尿液、藥品，并不適用于肉類的檢測；齊士林等[17]雖建立了動物源性食品中氯丙嗪和異丙嗪的檢測方法，但其方法定量限為5 μg/kg，不能滿足目前獸藥殘留痕量檢測的需要。因此迫切需要建立適用于畜肉及其內臟中異丙嗪的高靈敏度、低檢出限的檢測方法。

本實驗室在之前的工作中發表了鮮凍肉中6 種保水藥物的檢測方法[24]，本實驗旨在建立一種適用于動物肌肉、腎臟、肝臟等多種基質中異丙嗪檢測的方法，彌補當前國家標準的缺失，為注水肉的檢測提供有效手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽酸異丙嗪標準品（純度＞99%） 德國Dr.Ehrensorfer公司；甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純）國藥集團化學試劑有限公司；水為一級水。

1.2 儀器與設備

1260高效液相色譜儀-6470串聯四極桿質譜 美國Agilent公司；UPLC-Q Exactive HF-X超高效液相色譜-復合四極桿-軌道阱質譜儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；S-100渦旋儀、SR-IIw振蕩器 日本Taiyo公司；離心機 日本Hitachi公司；Milli-Q純水儀 美國Millipore公司；HLB固相萃取柱 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

標準溶液：準確稱取適量鹽酸異丙嗪（折算成異丙嗪，折算系數為88.6%）標準品10.0 mg，用甲醇溶解后稀釋至刻度，配制成質量濃度為100 mg/L的標準儲備液，置-18 ℃冰箱冷凍貯存。

標準中間使用液的配制：吸取1.00 mL標準儲備液于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為標準中間液，置-18 ℃冰箱貯存。

基質標準工作溶液：取一空白基質樣品（需根據樣品類型選取適合的空白基質），添加不同水平標準溶液，然后提取、凈化樣品，得到基質標準曲線。

1.3.2 提取

稱取均質后試樣5 g（精確至0.01 g）置于50 mL具塞塑料離心管中，加入10 mL酸化乙腈（0.1%甲酸），加蓋后渦旋混勻2 min，振蕩器振蕩30 min，10 000 r/min離心10 min，上清液倒入另一離心管中。于殘渣中再加入10 mL酸化乙腈（0.1%甲酸），同法操作重復上述步驟，合并兩次上清液，用旋轉蒸發器于40 ℃水浴減壓蒸發，將提取液減壓旋蒸至近干，加2.0 mL水復溶，待凈化。

1.3.3 凈化

HLB凈化柱使用前依次用3 mL甲醇和3 mL水活化，保持柱體濕潤。將待凈化液加入固相萃取小柱，流速控制在1 mL/min內，用3 mL水淋洗小柱，棄去全部流出液，最后用5 mL甲醇洗脫，回集洗脫液。洗脫液在40 ℃氮吹至近干，加入甲醇1.00 mL渦旋混勻，0.22 μm濾膜針頭濾器過濾后供高效液相色譜-串聯質譜測定。實驗均平行3 次。

1.3.4 儀器條件

1.3.4.1 高效液相色譜-串聯質譜條件

色譜條件：色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱溫30 ℃；進樣體積5 μL；流動相：A為甲酸-水溶液（1∶99，V/V），B為乙腈；流速0.40 mL/min。洗脫梯度見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

質譜條件：電噴霧離子源（e l e c t r o n s p r a y ionization，ESI），噴霧電壓3 500 V，輔助氣氣化溫度300 ℃，鞘氣流速12 mL/min，鞘氣溫度350 ℃。多反應監測質譜參數見表2。

表2 異丙嗪多反應監測質譜參數Table 2 Mass spectrometric parameters in MRMmode for promethazine

1.3.4.2 高分辨液相色譜-質譜條件

色譜條件同1.3.4.1節，高分辨質譜條件：離子源參數：輔助氣溫度320 ℃；鞘氣壓力4 arb；輔助氣壓力15 arb；Scan分辨率120 000；二級分辨率60 000。掃描離子見表3。

表3 異丙嗪高分辨質譜參數Table 3 QE MS parameters for promethazine

2 結果與分析

2.1 色譜條件優化

異丙嗪為弱極性化合物，在C18柱上有較好的保留，且相對于C8色譜柱，C18柱對弱極性化合物中極性更強的一類化合物有更好的保留分離效果。異丙嗪含有氨基，容易失去H+得到[M+H]+型分子離子峰，因此選取ESI+模式檢測；通過對比乙腈+水、乙腈+甲酸溶液（0.1%）、甲醇+水、甲醇+甲酸溶液（0.1%）等不同流動相類型，發現在正離子模式下乙腈+甲酸溶液（0.1%）作為流動相可以得到較好的目標物分離度及峰形，水相中加入0.1%甲酸，降低了流動相的pH值，有助于目標物的離子化，從而提高了目標物響應值。在ESI+模式下，得到準分子離子峰[M+H]+，并對離子源參數進行優化，再以準分子離子為母離子，通過氮氣碰撞產生碎片離子進行二級質譜掃描，得到穩定的碎片離子作為子離子；以此為定性依據，然后優化碰撞電壓及碰撞能量。由圖2可以看出，異丙嗪在肉類基質中得到有效分離且響應值滿足實驗要求。

圖2 異丙嗪總離子流圖及定量和定性離子流圖Fig. 2 Total ion current chromatograms and MRM chromatograms of quantitative and qualitative ion pairs

2.2 提取條件優化

異丙嗪易溶于水和乙腈，對比了加標量為2 μg/kg，乙腈、含0.1%甲酸的乙腈溶液、含10%水的乙腈溶液作為提取溶劑的回回率。圖3表明：乙腈作為提取溶劑時[25-26]，由于其極性較強，更容易提取出樣品中的雜質；相比于乙腈+水，用酸化乙腈作提取溶劑時，異丙嗪可以得到更好的提取效率，且不會引入過多的雜質，回回率最高。故本實驗選取酸化乙腈作為異丙嗪殘留量檢測的提取溶劑。

圖3 提取溶劑對回收率的影響Fig. 3 Effect of extraction solvents on the recovery of promethazine

2.3 凈化條件的選擇與優化

由于異丙嗪屬于脂溶性化合物，同時在畜肉及其內臟基質含有大量蛋白質及脂肪，不宜選用液液萃取[27]作為凈化方式，因此需選取固相萃取柱對其進行除雜。實驗選取HLB、C18、MCX、PEP四種SPE凈化柱進行比對，發現由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮填料組成的HLB固相萃取柱相較于其他固相萃取柱在穩定性、凈化效果以及蛋白、脂肪等雜質的去除方面都有很大優勢，對比2 μg/kg添加量目標化合物的回回率結果，HLB柱優于C18柱、MCX柱及PEP柱（圖4）。故本實驗選取HLB柱作為凈化小柱。

圖4 SPE柱對回收率的影響Fig. 4 Effect of SPE columns on the recovery of promethazine

2.4 方法學結果

2.4.1 基質效應

基質效應是由于與被分析物一起流出的其他內源性物質造成的，例如鹽類、胺類、脂肪酸、甘油酸酯等，這些干擾物與目標化合物共同流出噴霧針可影響待分析物的霧化、揮發、裂分、化學反應及帶電過程，導致進入質譜的離子減少（離子抑制）或增多（離子增強），從而影響定量結果的可靠性和準確性[28-29]。

通過繪制溶劑標準曲線和基質匹配標準曲線，采用基質效應評價畜肉及其內臟的基質效應大小[30]。

基質效應/%=[（基質匹配標準曲線的斜率-溶劑標準曲線的斜率）/溶劑標準曲線的斜率]×100

其中，-20%＜基質效應＜+20%，基質效應處于抑制狀態；-50%＜基質效應＜-20%，+20%＜基質效應＜+50%，基質效應為中等效應，基質效應處在不會增強或抑制狀態；基質效應＜-50%，基質效應＞+50%，基質效應是增強狀態。

由結果可見，異丙嗪的基質效應為-74%，表明本實驗的基質效應會對實驗結果產生影響，因此需要通過配制基質標準曲線扣除基質帶來的影響。

2.4.2 線性與檢出限和定量限

配制空白基質標準曲線，添加質量濃度為0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL，得到異丙嗪在6 個質量濃度水平下繪制的線性方程，相關系數在0.999以上，線性范圍良好。以3 倍信噪比及10 倍信噪比確定檢出限及定量限分別為0.1 μg/kg和0.3 μg/kg，結果見表4。

表4 異丙嗪的回歸方程、相關系數、檢出限、定量限Table 4 Regression equation, correlation coefficient, LOD and LOQ of promethazine

2.4.3 回回率及精密度

選取5 種不同空白基質樣品，稱樣量5.0 g左右，分別添加0.2、1.0、5.0 μg/kg水平后測定，做6 次平行實驗，結果見表5。結果表明不同基質的添加回回其回回率在85.7%～102.0%之間，相對標準偏差在0.9%～7.4%之間，均符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》中要求。

=6）Table 5 Recoveries for promethazine in different spiked samples (n= 6)表5 不同基質中加標回收率結果（n

2.5 高分辨液相色譜-質譜法定性篩查

基于實際檢測過程中發現的問題，異丙嗪等噻吩嗪類藥物在檢測過程中容易受到基質的影響干擾而影響質譜的確證，因此建立高分辨篩查方法有助于對目標物的確認。通過基質標準曲線的異丙嗪化合物精確分子質量確認實際檢測樣品中的異丙嗪存在情況。通過圖5可以得到異丙嗪在肉類基質中的精確分子質量，且不會受附近同分異構體化合物的干擾，達到有效確證的目的。

圖5 高分辨譜圖Fig. 5 High resolution spectrogram

2.6 陽性樣品篩查

通過本方法對市售的100 件畜肉及其內臟產品進行檢測，樣品囊括牛、羊、豬肉等及其副產品，結果在30 件牛、羊肉樣品中檢出異丙嗪，含量為2.0～5.2 μg/kg，通過高分辨比對發現均為異丙嗪目標物，其余樣品均為檢出。

3 結 論

本實驗建立了一種適用于肌肉、腎臟、肝臟等多種基質中異丙嗪的高效液相色譜-串聯質譜檢測方法。該方法操作簡單、快速、準確性好，檢測限低、靈敏度高，同時輔助高分辨質譜分析方法確證目標化合物，可應用于異丙嗪的分析檢測。本方法的建立，彌補了當前國標的缺失，為打擊注水肉的不法行為提供了有效的監測有段。