基于氣相離子遷移譜檢測靜電場處理的大菱鲆品質

陳東杰，張明崗，聶小寶，姜沛宏，張玉華,*，張長峰，任 芳

（1.山東省農產品貯運保鮮技術重點實驗室，山東 濟南 250103；2.國家農產品現(xiàn)代物流工程技術研究中心，山東 濟南 250103；3.濰坊工程職業(yè)學院，山東 青州 262500；4.山東海能科學儀器有限公司，山東 德州 251500）

大菱鲆（Scophthalmus maximus）因肌肉白嫩、高蛋白、低脂肪、口感爽滑鮮嫩、風味獨特等特點，深受廣大消費者喜愛。因其肌肉柔軟，含水量高，體內組織酶類活性強，在貯藏過程中極易滋生微生物，致使魚肉腐敗變質，造成重大經濟損失[1-2]，研究其保鮮技術具有重大意義。目前魚肉保鮮方法有氣調貯藏、冷凍和保鮮劑涂膜[3-5]等。氣調貯藏及射線對場地和設備要求較高；冷凍貯藏解凍后影響大菱鲆風味及口感；保鮮劑涂膜操作繁瑣、不易操作且不利于商業(yè)化。靜電場貯藏保鮮技術是一種新型的食品保鮮技術，可影響生物體某些生物酶的活力，一定頻率和強度的靜電場可抑制微生物生長與繁殖。目前靜電場技術已應用在番茄、草莓、雞蛋、羅非魚[6-9]貯藏中，但目前尚無靜電場對大菱鲆貯藏效果的研究。

氣相色譜離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）是一種將離子遷移譜技術和氣相色譜技術兩者結合的檢測技術[10]，此檢測技術克服離子遷移譜技術分離度差的局限性，使得離子遷移譜信號響應經氣相預分離后質量上得到顯著改善，而離子遷移譜通過漂移時間信息又使得氣相色譜分離后得到的化學信息更加豐富；GC-IMS技術充分發(fā)揮了不同儀器各自的優(yōu)點，產生長處相互疊加的優(yōu)勢[11-12]。該技術具有快速、靈敏、無需前處理、簡單的優(yōu)點，已應用于食品風味分析、品質檢測等多個領域[13-16]。

本實驗探討4 ℃貯藏靜電場處理對大菱鲆貯藏品質指標如總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）、假單胞菌及菌落總數(shù)等影響。利用GC-IMS技術測定靜電場處理大菱鲆的揮發(fā)性物質組成成分及其相對含量的變化，為大菱鲆風味物質的分離鑒定、指紋圖譜的構建及風味物質的理論研究提供參考。通過電子鼻對不同貯藏時間內大菱鲆進行連續(xù)的氣味指紋信息采集，采用不同化學計量學方法進行快速統(tǒng)計分析，為大菱鲆貯藏期品質檢測提供簡便、實用、快捷、準確的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大菱鲆購自于山東海鮮大市場，挑選體型較大，同一年齡、新鮮、健康、活躍的大菱鲆，保活運至實驗室，暫養(yǎng)24 h后停食，宰殺。去除頭、尾、內臟及魚鱗，用蒸餾水沖洗后分割為大小相近、厚薄均勻的魚肉（50±5.0）g，用保鮮膜包裝，置于冷庫（4±0.5）℃貯藏。

1.2 儀器與設備

F6/10-104-S組織破碎機 上海弗魯克流體機械制造有限公司；EL204-IC電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；BL-75A高溫滅菌鍋 上海博迅實業(yè)有限公司；RX-2智能型人工氣候培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；MS3 digital渦旋混勻器 德國艾卡設備有限公司；PL-CJ-2N超級潔凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；Scientz-04無菌均質器 寧波新芝生物科技股份有限公司；LRH-70培養(yǎng)箱 上海藍豹實驗儀器有限公司；K110F凱氏定氮儀 濟南海能儀器有限公司；FOX4000電子鼻 法國Alpha MOS公司。FlavourSpec 1H1-00053型GC-IMS 德國G.A.S.公司；CTC-PAL自動進樣裝置 瑞士CTC Analytics AG公司；CLOT毛細管柱（30 mm×0.25 mm，0.50 μm） 德國CS Chromatographie Service GmbH公司；77-1型磁力攪拌器 天津賽得利斯儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 靜電場處理

圖1 大菱鲆靜電場處理示意圖Fig. 1 Schematic illustration of the electrostatic field for treating S. maximus

處理大菱鲆的靜電場裝置為實驗室自制，如圖1所示。本實驗采用交流電場（～220 V），經圖1中的控制器加到高壓電源上，通過高壓電纜，產生4.0～5.0 kV/m的靜電場；同時可產生較多的臭氧和負離子，將分割完成包裝大菱鲆置于負極平板上，與接地正極板間距為50 cm，對照組置于不通電極板，不用任何靜電場處理。分別于第0、4、6、8、10、12、14天取樣品，測定TVB-N值、菌落總數(shù)、假單胞菌數(shù)、TBA值，利用電子鼻進行氣味指紋分析，并采用GC-IMS對大菱鲆貯藏期間揮發(fā)性風味物質進行測定分析。

1.3.2 TVB-N值測定

按照GB/T 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[17]方法測定。

1.3.3 菌落總數(shù)測定

按照GB/T 4789.2—2016《食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》[18]方法進行。

1.3.4 假單胞菌測定

采用CFC假單胞菌瓊脂培養(yǎng)基，在28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，計數(shù)。

1.3.5 TBA值的測定

參照李婷婷等[5]方法。稱取10.0 g攪碎魚肉于燒杯中，加入25 mL蒸餾水和25 mL 10%的三氯乙酸溶液，均質，靜置30 min過濾。取5 mL上清液于比色管中，然后方比色皿中加入5 mL的TBA溶液（0.02 mol/L）。將上述混合液在（80±1）℃的恒溫水浴加熱40 min，之后冷卻至室溫，在532 nm波長處測定吸光度。TBA值以丙二醛（malondialdehyde，MDA）質量計算，單位為mg/100 g。

1.3.6 電子鼻檢測

稱取2.0 g攪碎的肉樣裝入10 mL樣品瓶，加蓋密封，每個樣品重復6 次。實驗前先對電子鼻測定參數(shù)進行優(yōu)化，根據(jù)傳感器的響應信號，確定電子鼻的測定參數(shù)為：載氣流速150 mL/min，頂空產生溫度40 ℃，進樣體積2 500 μL，進樣速率2 500 μL/s，頂空產生時間600 s，數(shù)據(jù)采集時間120 s，延滯時間400 s。采用主成分分析（principlal component analysis，PCA）和線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）對樣品進行分析，去除樣品中差異較大的個體。

1.3.7 GC-IMS測定條件

1.3.7.1 頂空進樣條件

頂空孵化溫度45 ℃；孵化時間10.0 min；加熱方式：振蕩加熱；頂空進樣針溫度50 ℃；進樣量500.0 μL，不分流模式；載氣：高純氮氣（純度≥99.999%，推斷和清洗進樣針）；清洗時間0.50 min。

1.3.7.2 GC-IMS條件

色譜柱溫度40 ℃；運行時間15 min；載氣：高純N2（純度≥99.999%）；流速：初始5.0 mL/min，保持10 min后在5 min內線性增至150 mL/min。漂移管長度5 cm；管內線性電壓400 V/cm；漂移管溫度40 ℃；漂移氣（高純N2，純度≥99.999%）；流速150 mL/min；IMS探測器溫度45 ℃。

1.3.8 檢測方法

取3.0 g樣品，放入20.0 mL頂空進樣瓶中，45 ℃孵化10.0 min，經頂空進樣用FlavourSpec?風味分析儀進行測試，經G.A.S公司開發(fā)的強大功能軟件分析可給出樣品中揮發(fā)性有機物的差異譜圖；軟件內置的NIST數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫可對物質進行定性分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05，差異顯著；運用PCA、LDA對數(shù)據(jù)進行處理，結果由Origin pro 2016軟件進行繪圖，二維可視化軟件為LAV 2.0（G.A.S. Inc.）。

2 結果與分析

2.1 大菱鲆冷藏過程中品質指標變化

2.1.1 TVB-N值

圖2 靜電場對大菱鲆中TVB-N值的影響Fig. 2 Time-dependent effect of electrostatic field on TVB-N content in S. maximus

如圖2可知，在貯藏過程中，大菱鲆的TVB-N值不斷升高，貯藏前8 d，靜電場處理組與對照組的TVB-N值變化均較小，兩者無顯著性差異（P＞0.05）。第8天后對照組和靜電場處理組呈快速增長趨勢，根據(jù)我國水產品鮮度的國家標準TVB-N不大于30 mg/100 g[19]為新鮮，對照組貯藏至第10天已超過30 mg/100 g，大菱鲆已呈現(xiàn)明顯腐敗特征，而靜電場處理組至第12天才超過30 mg/100 g，反映出靜電場處理可延緩大菱鲆新鮮度下降。

2.1.2 菌落總數(shù)

菌落總數(shù)指標是判斷魚類新鮮度重要的指標。由圖3可知，整個貯藏期間，大菱鲆菌落總數(shù)整體呈現(xiàn)明顯增長趨勢。靜電場處理組與對照組的增長趨勢大體一致，但對照組的菌落總數(shù)在在貯藏期間始終高于靜電場處理組。根據(jù)GB/T 4789.2—2010規(guī)定的方法測定，當細菌總數(shù)大于6（lg（CFU/g））時，判定肉樣變質，對照組在貯藏至第10天后超過6（lg（CFU/g）），而靜電場處理組在第12天后超過6（lg（CFU/g））。對照組在貯藏至第10天后開始腐敗，而靜電場處理組在12 d后腐敗，說明靜電場處理一定程度上抑制微生物生長。

圖3 靜電場對大菱鲆中菌落總數(shù)的影響Fig. 3 Time-dependent effect of electrostatic field on TBC in S. maximus

2.1.3 假單胞菌數(shù)

假單胞菌為大菱鲆冷藏條件下的優(yōu)勢腐敗菌之一[20]。由圖4可知，隨著大菱鲆貯藏時間延長，假單胞菌呈快速增長趨勢。貯藏前8 d，對照組與靜電場處理組的假單胞菌增長趨勢一致，無顯著性差異（P＞0.05）。而貯藏8 d后，對照組假單胞菌增長速度明顯高于靜電場處理組，靜電場處理組的假單胞菌數(shù)顯著低于對照組（P＜0.05），說明靜電場可以抑制假單胞菌的生長，其原因可能是假單胞菌為原始生物，體內存在與類似微管蛋白功能的物質[21]，在電場作用而導致其細胞分裂出現(xiàn)異常。

2.1.4 TBA值

魚肉肌肉組織富含大量不飽和脂肪酸，而不飽和脂肪酸氧化產物MDA可以與TBA產生穩(wěn)定紅色物質，其紅色物質在532 nm波長處有最大吸回峰。TBA可以反映出大菱鲆組織肌肉被氧化的程度，TBA值越大，表明魚肉的脂肪氧化程度越高。如圖5所示，貯藏前8 d，靜電場處理組和對照的TBA值增長緩慢；貯藏8 d后，對照組和靜電場處理組的TBA值呈現(xiàn)快速增長趨勢，而靜電場處理組增長速率明顯低于對照組說明靜電場能夠降低脂質氧化程度，這與趙良等[22]研究靜電場可以抑制羅非魚的脂肪氧化的結果一致，但貯藏到第14天時靜電場處理組與對照組并無顯著差異（P＞0.05）。

圖5 靜電場對大菱鲆中TBA值的影響Fig. 5 Time-dependent effect of electrostatic field on TBA value in S. maximus

2.2 大菱鲆電子鼻傳感器響應值分析

LDA是利用已知類別的樣品建立判別模型，為未知類別的樣本判別的一種統(tǒng)計方法[23]。圖6為貯藏期間大菱鲆電子鼻響應值的LDA結果，LD1和LD2的貢獻率分別為70.53%和24.47%，兩者累計貢獻率為95.00%。說明這兩個主成分基本上可以反映出大菱鲆所有的特征信息。LDA可將不同貯藏時間下靜電場處理組和對照組的大菱鲆區(qū)分開，且沒有重疊區(qū)域。

圖6 貯藏期間大菱鲆電子鼻響應值信號的LDAFig. 6 LDA plot of e-nose sensor signals for S. maximus during storage

圖7 貯藏期間大菱鲆電子鼻響應值信號的PCAFig. 7 PCA plot of e-nose sensor signals for S. maximus during storage

PCA是將多個指標通過降維轉換成少數(shù)幾項具有代表性的綜合指標的一種多元統(tǒng)計分析方法[24]。通常認為累計貢獻率超過80%，表明基本包含樣品的信息。PC1和PC2的貢獻率分別為98.27%和1.17%，兩者累計貢獻率為99.44%。說明這兩個主成分基本上可以反映出大菱鲆所有的特征。從圖7可以看出，PCA可將不同貯藏時間下對照組和靜電場處理組的大菱鲆品質區(qū)分開，且沒有重疊區(qū)域。

2.3 靜電場處理二維譜圖分析

圖8 大菱鲆的GC-IMSFig. 8 GC-IMS profiles of S. maximus

圖8 為靜電場處理和對照組大菱鲆揮發(fā)性物質的組分差異變化，第0天大菱鲆樣品為參比，以便觀察不同貯藏時間大菱鲆揮發(fā)性物質與參比樣品之間的差異。反應離子峰右側的每一個點代表一種揮發(fā)性有機物，藍色為背景，紅色代表物質成分，顏色越深表示含量越高。從圖8可以看出，不同處理方法及不同貯藏時間內揮發(fā)性組分可通過GC-IMS技術很好地分離，且可直觀看出不同貯藏時間段的揮發(fā)性物質差異，根據(jù)揮發(fā)性物質氣相色譜保留時間和離子遷移時間對揮發(fā)性組分進行定性分析。大菱鲆貯藏過程中，共計檢測出66 種揮發(fā)性物質，通過內置的NIST 2014氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫與G.A.S的IMS遷移時間數(shù)據(jù)庫進行二維定性，確定了28 種具體揮發(fā)性物質組成（表1）。為更加方便地對比不同樣品間揮發(fā)性有機物的差異，LAV軟件的Gallery Plot插件可選取圖中所有的待分析區(qū)域，自動生成指紋圖譜。

由圖9可知，將對照組處理大菱鲆指紋圖譜分成A、B、C、D、E 5 個區(qū)域，區(qū)域A標出的物質在新鮮大菱鲆中含量最高，隨著貯藏時間的延長，A區(qū)此類物質比如3-甲基丁醇、戊醛、苯乙醛、異丁烯等物質消失。區(qū)域B為大菱鲆貯藏6 d后出現(xiàn)的揮發(fā)性物質，C區(qū)域為存放10 d時出現(xiàn)苯甲醛、環(huán)己酮等特殊揮發(fā)性物質，區(qū)域D標出的物質在存放14 d中存在，14 d之前的樣品中含量較少，例如2,3-丁二酮（飯膄味）此類物質的存在與否可判斷大菱鲆的貯藏時間；區(qū)域E中標出的物質在存放10 d后開始出現(xiàn)，例如2-庚酮、乙酸異丙酯、異戊酸乙酯、1-戊醇等隨著貯藏時間延長而增加。A區(qū)域標注的物質在存放5 d的大菱鲆中含量很少，而2,3-戊二酮、2-戊酮、2-甲基丁酸甲酯、1-辛烯-3-醇、3-甲硫基丙醛、丁酸乙酯、2-庚酮等此類物質在新鮮的大菱鲆中及存放10 d后的大菱鲆中均存在，具體原因有待進一步研究。

表1 大菱鲆揮發(fā)性組分的定性Table 1 Volatile compounds of S. maximus identi fied by GC-IMS

圖9 對照組大菱鲆不同貯藏時間指紋圖譜Fig. 9 Fingerprint profiles of control group at different storage times

圖10 靜電場處理下大菱鲆的指紋圖譜Fig. 10 Fingerprints of electrostatic field-treated group at different storage times

由圖10可知，將靜電場處理大菱鲆指紋圖譜分成A、B、C 3 個區(qū)域，區(qū)域A中標出的物質在新鮮大菱鲆中存在，貯藏6 d后區(qū)域A類揮發(fā)性有機物如1-辛烯-3-醇、苯乙醇、苯乙醛等，僅有苯乙醛尚可檢測出其含量。區(qū)域B中標出的物質如正己醇、2-丁酮等僅在貯藏中5 d時生成，貯藏10 d后B區(qū)域的物質消失。C中標出的物質如環(huán)己酮、苯甲醛、丁酸乙酯等中存放10 d后含量最高，通過此類物質可判斷大菱鲆大致貯藏時間。C區(qū)域揮發(fā)性物質如3-甲硫基丙醛、正戊醛、3-甲基-1-丁醇、1-戊醇、正己醛、甲基丙基甲酮、2,3-戊二酮等在靜電場中存放10 d及14 d后此類物質含量極劇減少此類物質的存在及含量可用于判斷大菱鲆在靜電場中的存放時間，區(qū)域B中標出的物質在存放10 d的大菱鲆樣品中含量最少，在存放14 d的樣品中含量最高。

圖11 不同處理處理下大菱鲆的指紋圖譜Fig. 11 Fingerprints of S. maximus with different treatments

如圖11可知，揮發(fā)性有機物如2-丁酮、正己醇、環(huán)己酮、2-甲基丁酸甲酯、乙酸異丙酯、1-戊醇、苯甲醛、甲基丙基甲酮、2,3-戊二酮等在對照組中含量最高，而在靜電場中處理的樣品此類物質含量很少，即不同處理方式的樣品揮發(fā)性有機物的種類不同。通過對照組及靜電場處理的對比可知，相同的存放時間下，靜電場中大菱鲆中揮發(fā)性有機物的種類和含量明顯少于對照組中，即驗證了靜電場了延長大菱鲆的貨架期。

3 討 論

新鮮魚肉變質腐敗主要是優(yōu)勢腐敗菌大量活動繁殖造成[25]，采用靜電場處理的魚肉后與對照組相比，表現(xiàn)出更好的貯藏效果，可將菌落總數(shù)、假單胞菌數(shù)、TBA值和TVB-N值維持相對較低的水準。這與岑劍偉等[9]研究高壓靜電場對延長羅非魚片的貨架期和陳文波等[26]研究靜電場可抑制白切雞的微生物結果一致。靜電場可能通過改變微生物體內生命大分子電荷分布，影響其體內酶的活性，進而影響酶與底物的接觸反應，從而影響微生物細胞的正常代謝活動[27-28]。靜電場雖可以抑制優(yōu)勢腐菌的生長，減緩微生物的生長速率，降低微生物對魚肉的破壞，在一定程度上，延長了大菱鲆魚肉的貨架期，但不能徹底殺死微生物，大菱鲆貯藏后期，微生物依舊大量繁殖致使大菱鲆腐敗。

目前，測定樣品中揮發(fā)性物質常用的檢測是采用氣相色譜-質譜或者頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯(lián)用測定，該方法需要破壞原始樣品進行前處理，通過譜圖庫檢索對應峰進行定性，計算峰面積進行定量，但碎片離子導致的解譜困難，不能做到快速無損檢測。而GC-IMS技術結合氣相色譜的分離能力和離子遷移譜快速響應、高靈敏度的優(yōu)勢，具有操作簡單、快速無損以及重復性好等特點。而且無需樣品前處理且分析的溫度遠低于相傳統(tǒng)的氣相色譜-質譜法，GC-IMS法測得揮發(fā)性物質更真實反映貯藏環(huán)境的樣品的揮發(fā)性物質[29-31]。本研究采用GC-IMS技術對靜電場處理和對照組不同貯藏時間大菱鲆的揮發(fā)性物質檢測，檢測結果很直觀展現(xiàn)出采用靜電場處理與對照組的大菱鲆在貯藏過程中產生揮發(fā)性物質的差異。可以看出揮發(fā)性有機物如1-辛烯-3-醇、苯乙醇、苯乙醛，只存在于貯藏前6 d，可用于判斷大菱鲆在靜電場中的貯藏時間。貯藏到第14天時，靜電場處理的魚肉揮發(fā)性物質明顯少于對照組，原因可能是靜電場抑制微生物分解為肌肉中蛋白質、氨基酸等物質。大菱鲆貯藏過程中，共計檢測出66 種揮發(fā)性物質，GC-IMS檢測出的66 種物質均可以提供保留指數(shù)，GC-IMS定性依據(jù)是基于GC-MS數(shù)據(jù)庫，即使用氣相保留指數(shù)和離子遷移時間進行二維定性。但由于目前IMS數(shù)據(jù)庫在水產領域的數(shù)據(jù)庫還不完善，66 種化合物中只有28 種揮發(fā)性有機物有遷移時間，故二維定性只能給出28 種物質的定性結果。定性剩余38 種揮發(fā)性物質，有待于進一步研究。

4 結 論

靜電場保鮮技術可有效延長大菱鲆的貨架期，可抑制大菱鲆菌落總數(shù)和優(yōu)勢腐敗菌（假單胞菌）生長繁殖，降低TVB-N和TBA產生，使其維持在較低水平。通過GC-IMS技術可以快速檢測不同方法處理大菱鲆產生的揮發(fā)性物質。利用電子鼻對大菱鲆連續(xù)的指紋信息采集，結合PCA和LDA化學計量學方法處理，可以將不同貯藏時間下靜電場處理與對照組樣品區(qū)分開。說明GC-IMS和電子鼻都可用于大菱鲆品質快速檢測。本實驗雖然研究了靜電場對貯藏過程大菱鲆魚肉新鮮度的影響，但對其產生作用機理和靜電場對大菱鲆營養(yǎng)品質是否產生影響都未進行深入細致分析，需要后續(xù)進一步深入研究。